谷胱甘肽转硫酶的制备 及动力学研究

1. 谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容： （一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 （二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 （三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力

2. 蛋白质定量测定常见的方法 目前常用的蛋白质含量测定方法有两类：一类是利用蛋白质的物理化学性质，另一类是利用化学方法来测定，可以根据实验要求和实验室条件选择适当的测定方法。

3. • 紫外吸收法：利用蛋白质在280nm处有吸收高峰，操作简便，不损失样品，受核酸的干扰。 • 双缩脲法：利用蛋白质的双缩脲反应测定，常量法灵敏度较低，但操作简便，硫酸铵不干扰，利于蛋白质纯化早期步骤的快速测定；微量法灵敏度高。 • 凯式定氮法：将蛋白质样品消化，测定其无机氮量，由此计算出蛋白质含量，反应灵敏准确，操作复杂，一般用来标定标准蛋白质。 • Folin法：包含双缩脲反应和酚试剂反应，反应灵敏，但干扰因素多，是当前生化实验室常用的蛋白质定量测定的方法之一。 • 考马斯亮蓝法：利用考马斯亮蓝染料于蛋白质结合的原理，灵敏度高，缺点是在标准蛋白较大时标准曲线弯曲。 • BCA法：在碱性溶液中，蛋白质的肽键与Cu2+生成络合物，同时将其还原成Cu+，BCA特异地与Cu+结合生成紫色复合物，此方法灵敏，操作简便，试剂稳定。

4. 双缩脲 Cu2+-蛋白质络和物 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理 第一步反应：：蛋白质的肽键与双缩脲结构相似，与甲试剂中的酒石酸钾钠-铜盐溶液起作用，发生双缩脲反应，在碱性条件下，生成Cu2+-蛋白质络和物。双缩脲反应仅与蛋白质的肽键结构有关，不受蛋白质氨基酸组成差异的影响。

5. 第二步反应：乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸等组成，在酸性条件下较稳定，在碱性条件下易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此方法也适用于测定酪氨酸、色氨酸含量的测定。第二步反应：乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸等组成，在酸性条件下较稳定，在碱性条件下易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此方法也适用于测定酪氨酸、色氨酸含量的测定。 此方法是在Lowry等人在酚试剂法的基础上引入了双缩脲反应，使反应灵敏度提高，由蛋白质氨基酸组成引起的偏差减小。Lowry法灵敏度高，操作简便，但干扰因素较多，在测定之前应排除干扰因素或做空白实验消除。

6. 操作步骤每人取16支试管，按下表平行操作：

7. 注意事项 1. 用移液管准确移取溶液，要求标准蛋白质用差量法，溶液尽量放入试管底部。 2. 注意加样顺序和平行操作。 3. 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内。 4. 加入乙试剂后，应迅速混匀（加一管混匀一管），避免乙试剂被破坏。

8. 数据处理 1．绘制标准曲线：每一点吸光值取平均，并扣除空白管的吸光值，以其为纵坐标，每管标准蛋白质含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线应过原点； 2. 计算待测蛋白质溶液的浓度：用待测蛋白质的吸光值在标准曲线上查出其对应的蛋白质含量，根据实验中所加入待测蛋白质溶液的体积计算出其浓度（μg/mL或mg/mL）；

9. 3. 计算谷胱甘肽转硫酶的比活力：根据酶液的蛋白质含量和测定酶活力时所用的酶液体积，计算出测定酶活力所用蛋白质的量，进而计算出酶的比活力。