Pesquisa de propriedades anti-inflamatórias da planta Prunus lusitanica Search anti-inflammatory properties of the plan

1. Pesquisa de propriedades anti-inflamatórias da planta Prunus lusitanica Search anti-inflammatory properties of the plant Prunus lusitanica Gonçalves Duarte P,bCosta MC,a,bRosado C,bNogueira T,aTeixeira A,aRodrigues ALa a INETI – Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação, I.P., Estrada do Paço do Lumiar, 1649-038 Lisboa, Portugal bUniversidade Lusófona (Unidade de Dermatologia Experimental-Departamento de Ciências da Saúde), Campo Grande, 376, 1749-024, Lisboa, Portugal INTRODUÇÃO As formulações actuais para aplicação na pele devem satisfazer requisitos de eficácia elevada, compatibilidade cutânea e atracção estética. É geralmente aceite que o desempenho de um produto cosmético está relacionado com a tecnologia de todas as etapas da formulação. Assim, uma forma galénica óptima é um pré-requisito tão necessário para sucesso no mercado como a incorporação dos ingredientes activos adequados. O objectivo de formulações tópicas pode ser classificado em duas áreas principais: modular ou suportar a função de barreira da pele e actuar como sistema de libertação para ingredientes activos. Além disso, a possibilidade de utilizar uma formulaçáo galénica patenteada torna-se progressivamente mais importante como instrumento de marketing. Este trabalho constitui a primeira fase do desenvolvimento de conceitos de formulação galenicamente interessantes e utilizados em produtos dermocosméticos na actualidade. Conhecida popularmente em Portugal como "ginjeira brava" ou "loureiro de Portugal", a Prunus lusitanica L. nunca foi estudada de forma “bioconduzida” nem valorizada como fonte de fármacos de origem natural, apesar do seu enorme potencial devido a um elevado conteúdo em terpenos. Até ao momento, apenas existem 34 artigos na literatura mencionando a planta e apenas um estudo da sua composição química (1). Este refere o isolamento e identificação de triterpenos: aldeído ursólico, ácido ursólico e friedelina (2,3). A estas substâncias estão já atribuídas propriedades antimicrobianas (4), propiedades anti-inflamatórias (8) e são conhecidas como promotoras da permeação transcutânea (6). Ambas são plenamente justificadoras da sua inclusão em formulações para aplicação sobre a pele. PARTE EXPERIMENTAL Foram recolhidas as partes aéreas (folhas e caules) da planta nos locais de Sardal (N 40º 12' 23.8'', W 7º 55' 57. 94'' e no vale entre Sardal e Pai das Donas (N 40º 12' 47.09'', W 7º 56' 23. 00'') nos dias 11 e 12.10.2008 e procedeu-se à respectiva secagem ao ar e ao abrigo da luz. Um exemplar foi depositado no Herbário do Instituto Superior de Agronomia (Lisboa, Portugal) com a referência: LISI: 393/2009. Extracção com Solventes - As partes aéreas secas foram pulverizadas em moinho Cemotec 1090 Sample Mill, Tecator. Extraiu-se o material vegetal (2 X 45g) com éter de petróleo e diclorometano em aparelho de Soxhlet e também pelo método de Accelerated Solvent Extraction (ASE) da Dionex, sob pressão, utilizando os mesmos solventes e também metanol. Os extractos foram comparados por TLC (Cromatografia em Camada Fina) e RMN de protão e carbono (Fig.1). Do extracto de éter de petróleo em Soxhlet, depois de seco, foi retirada uma amostra de 389,6 mg a qual foi submetida a purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel Merck 60 (230-400 mesh, 0,004-0,063 mm) à pressão normal e temperatura ambiente, usando como eluente EP/CH2Cl2 1:1 (1000 mL) e depois CH2Cl2. A separação foi seguida por cromatografia em camada fina obtendo-se 47 fracções das quais duas (N-3 e N-6) têm uma fragrância frutada muito agradável. 2º Congresso Iberoamericano de Fitoterapia, 1º Congresso da SPFITO, 5º Congresso de la SEFIT, 8 a 10 de Outubro de 2009 As condições cromatográficas para monitorização de triterpenos nos ensaios para avaliação de permeação cutânea no Modelo de transporte NLC a implementar são adaptadas do estudo publicado por P.A. de Oliveira et al., 2006 (7). Figura 2 - Modelo de transporte (NLC-Nanostructured Lipid Carriers) para os extractos (sólidos) de diclorometano e de éter de petróleo contendo maioritariamente Friedelinacapazes deformar dispersões concentradas com estabilidade a longo termo. Figura 1 - Comparação dos espectros de RMN de carbono dos extractos de diclorometano e de éter de petróleo, contendo maioritariamente Friedelina, cujosdesvios químicos do 13C são: 6.8 (C-23); 14.7 (C-24); 17.9 (C-25); 18.3 (C-6); 18.7 (C-7); 20.2 (C-26); 22.3 (C-1); 28.2 (C-20); 30.0 (C-17); 30.5 (C-13); 32.5 (C-15); 31.8 (C-30); 32.8 (C-21); 35.0 (C-29); 35.4 (C-19); 35.7 (C-11); 36.1 (C-16); 37.5 (C-9); 38.3 (C-13); 39.3 (C-22); 39.7 (C-14); 41.3 (C-6); 41.5 (C-2); 42.2 (C-5); 42.8 (C-18); 53.1 (C-8); 58.3 (C-4); 59.5 (C-10); 213.2 (C-3) Partículas Lipídicas Nanoestruturadas – Para produtos dermocosméticos modernos, sistemas de nanodispersão como nanopartículas lipídicas tornaram-se muito importantes como veículos potenciais para a libertação controlada de moléculas activas com distribuição óptima nas camadas da pele (9). As nanopartículas lipidicas têm estrutura semelhante a nanoemulsões. As suas dimensões oscilam tipicamente entre 50 a 1000 nm. A diferença reside no “core” lipídico no estado sólido (Figura 2) finamente disperso na matriz lipídica. A matriz aqui em estudo consiste de lípidos sólidos que são misturas de lipidos naturais de Prunus lusitanica. Para estabilizar as partículas lipídicas sólidas contra a agregação, são adicionados agentes tensoactivos ou polímeros, em que são preferidos lípidos naturais característicos também das nanoemulsões. • CONCLUSÃO • Foi confirmada a presença maioritária (26-63%, GLC) da Friedelina e outros dois triterpenos (entre 7 a 15% cada) em extractos das partes aéreas de Prunus lusitanica. A presença simultânea de aromas observada pode ser benéfica como aromatizante de formulações cosméticas se se verificar que apresentam uma boa compatibilidade cutânea. • Serão de seguida realizados ensaios sobre modelos de pele, tendo em vista a caracterização do potencial de extracto natural para aplicação dermatocosmética. • Devido às conhecidas propriedades anti-dermatófitas, anti-inflamatórias e de permeação da friedelina, estão em curso estudos de permeação in vitro dos terpenos presentes no extracto de Prunus lusitanica para avaliação, numa primeira fase, com uma membrana sintética (de polidimetilsiloxano- PDMS ) para afinar o protocolo. Assim que sejam obtidos bons resultados, serão feitos estudos com pele de porco, um modelo animal extensamente conhecido e validado (5), seguindo um protocolo corrente (6). As membranas (PDMS ou pele) serão montadas em células de difusão de Franz com área superfícial de 3,14 cm2 e um volume receptor de 10 ml. . RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram obtidos 5 extractos, onde predominam compostos alifáticos do tipo terpenóide, sendo maior o rendimento em triterpenos com o éter do petróleo, seguido de diclorometano e por último com metanol. Os extractos foram analisados por métodos cromatográficos, nomeadamente por Cromatografia Gás-Líquido (GLC) e métodos espectrais. A separação cromatográfica dos constituintes isolados do extracto em éter do petróleo num aparelho de Soxhlet conduziu a várias fracções identificando-se friedelina numa Fracção F3 (0,200 g; 51,28%). Obtiveram-se duas fracções N3 (10,27%) e N6 (23,10%) que têm fragrância frutada muito agradável, estando em curso a sua identificação por CG-MS e RMN. Foi desenvolvido um método analítico por GLC para determinação de triterpenos nos extractos obtidos de material vegetal colhido em épocas diferentes, e para a sua monitorização nos ensaios com modelos de pele, por adaptação do procedimento descrito por Patrícia Abrão de Oliveira et al. (7). (1) Hubertus W. A. Biessels, Antonetta C. van der Kerk-van Hoof, Jacoba J. Kettenes-van den Bosh, Cornelis A. Salemink, Triterpenes of Prunus serotina and P. lusitanica, Phytochemistry, 1974, 13, pp. 203-207 (2) Carvalho, JA., Batista-Marques, MI., Gouveia , L., Ferreira, SG., Fontinha, S., Dragovic, MJ. Avaliação da ecologia in situ de Prunus lusitanica spp. hixa, uma especie endemica das ilhas da Madeira e das Canarias. I Congresso Iberico de Ecologia, Santiago de Compostela, Espanha, 25- 28 Setembro (3) Carvalho, JA., Batista-Marques, MI., Gouveia , L., Ferreira, SG., Fontinha, S., Dragovic, M. J., Ecologia de Prunus lusitanica ssp. hixa - Efeito fitotoxico da planta mae? II Jornadas Florestais Insulares, Funchal, Portugal, 6-9 Setembro. (4) Abbas F.A., Al-Massarany S.M., Khan S., AL-Howiriny T.A., Mossa J.S., Abourashed E.A., Phytochemical and biological studies on Saudi Commiphora opobalsamum L., Natural Product Research, 21:5, May 2007 383 – 391. (5) Barteck, M.J., La Budde, J.A., Maibach, H.I., Skin permeability in vivo: comparison in rat, rabbit, pig and human. J Invest Dermatol, 1972, 58: 114-123 (6) OCDE Guideline for testing of Chemicals, 428 Skin Absorption: In Vitro Method (2004) (7) A. de Oliveira, P., Turatti, I.C.C., R. de Oliveira, D.C., Comparative analysis of triterpenoids from Mikanoia cordifolia collected from four different locations, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, 42:4. (8) YAO Quan-Sheng, George CY CHIOU, Inhibition of crystallins-induced inflammation in rabbit eyes with five phytogenic compounds, Acta Pharmacologica Sinica, 1993 Jan; 14(1):13-17 (9) El Maghraby G.M., Barry B.W., Williams A.C.Liposomes and Skin: From drug delivery to model membranes, European Journal of Pharmaceutical Sciences 3 4 (2 0 0 8) 203–222 REFERÊNCIAS