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南京农业大学动物科技学院曲亮 敬向与会专家、领导、企业家致意！

南京农业大学动物科技学院曲亮 敬向与会专家、领导、企业家致意！. mRNA 差异显示技术（ DD ）及其对动物育种的作用. 曲亮 黄瑞华 *  邱新深 刘红林 王林云 ( 南京农业大学动物科技学院，南京， 210095) 基金项目 ：江苏省高技术研究项目（ BG2005304 ）. DD 的发明及其基础. 由 Liang 于 1992 年创立 是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang 等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 基于 RT-PCR 理论，依赖于 3 种技术 1 ） RT-PCR 技术 2 ）以特定引物进行的 PCR 技术

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Presentation Transcript

  1. 南京农业大学动物科技学院曲亮 敬向与会专家、领导、企业家致意！

  2. mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用 曲亮 黄瑞华* 邱新深 刘红林 王林云 (南京农业大学动物科技学院，南京，210095) 基金项目：江苏省高技术研究项目（BG2005304）

  3. DD的发明及其基础 • 由Liang于1992年创立 • 是分离差异表达基因强有力的工具 • 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 • 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 • 1）RT-PCR技术 • 2）以特定引物进行的PCR技术 • 3）DNA电泳技术

  4. DD的原理

  5. M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA 5’ T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C) 5’ T12MN 3’ 锚定引物 逆转录 启动cDNA第一链合成 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 变性 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 5‘ T12MN 3’锚定引物 寡核苷酸随机引物 退火 随机结合到cDNA链上 M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ 不同长度的PCR产物 dNTP、Taq聚合酶 延长 M N TTTTTTTTTTTT 5’ 3‘ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 5’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对

  6. DD目前的应用领域 • 主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域 • 动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域

  7. DD的优点 • 以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 • 灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA • 可以同时比较多个样品间基因表达的差异 • 可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 • 时间短，实验过程中可步步验证比较 • 可进行多基因家族的表达分析

  8. DD的缺点 • 假阳性高 • 样品mRNA可能有部分降解 • 有少量的DNA污染 • 单条带可能由一种以上cDNA 片段所构成 • 有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号 • PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号 • 绝大多数差异条带仅含有3’-UTR 500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 • 对低丰度mRNA检出率低

  9. DD技术改进 • 针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进： • 引物设计 • 反应条件的优化 • 显示方法 • 假阳性鉴定

  10. DD在动物育种中的应用 • 比较不同品种间的差异 • 寻找数量性状QTL侯选基因 • 研究杂种优势机制 • 比较世代间的差异

  11. DD在现代动物育种中的应用展望 • 目前主要致力于两个品种或组合间比较 • 我们在苏淮白猪选育中的应用思路： • 提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立和完善繁殖性能和肉质性状的DD技术 • 分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关 • 检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离

  12. 衷心感谢各位与会者 敬请批评指正！

  13. 引物设计 • mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果最好 • 王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列，提高了PCR反应的严谨性 • Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜 • Liang还发现，当长度为13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性

  14. 反应条件优化 • RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带 • 不同条件下dNTP浓度不是固定不变的 • 1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好 • 40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严谨的退火温度36℃，在随后的循环中退火温度提高到45℃，获得了很清晰的电泳图谱

  15. 显示方法 • 最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像 • Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需15分钟，而且容易克隆回收 • Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段 • 余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，最大限度地降低了假阳性

  16. 假阳性的鉴定 • Northern blot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向Northern blot是较为切合实际的选择 • Heinz通过SSCP分析排除了非差异表达的cDNA污染 • Callard把纯化后的PCR 产物分成两部分:一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆 • Sompayra设计了向5’步移的方法

  17. 比较不同品种间的差异 • Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的mRNA，对10条差异表达cDNA克隆、测序，有6条cDNA显示与GenBank上已鉴定的基因类似，另外4条是未知基因

  18. 寻找数量性状QTL侯选基因 • Janzen等用DD分离的差异表达cDNA 片段与猪ARPP-16转录物的3‘末端一致，试验组猪ARPP-16的表达量比对照组高4倍,提示猪ARPP-16基因可能在猪肌肉生长中起重要作用 • S.Ponsuksili应用DD方法寻找猪眼肌面积的可能侯选ESTs，构建4个RNA池，显示了27条非共有条带，有2个克隆显示与已知基因有高同源性，2个克隆与EST序列相似 • M.D.Li等应用DD方法发现梅山猪的TSH-β基因过量表达，大约为成年WC猪的3倍，推测β亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系性成熟早的原因

  19. 研究杂种优势机制 • Y G Liu应用DD技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达的差异，观测到8个不同的典型表达模式，相关性分析表明，大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，而在大白、长白杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因表达偏向于某一亲本 • Liu(2005)等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的CA-Ⅲ基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优势是否相关

  20. 比较世代间的差异 • Ren等研究了梅山猪和大白猪及其正反F1代杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况，4 条 EST 分别与 GenBank 序列同源性较高，其余36条EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同

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