生物化学实验 （二）

1. 生物化学实验（二）

2. 绪　论 • 随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富，生物化学实验也在不断更新和提高。 • 本门课程在以往教学工作的基础上，结合生物化学实验教学，力求使学生能够更加深刻地学习生物化学课程。 本实验课实验项目覆盖了当今生物化学研究中常用的技术和方法。

3. 绪　论 一、实验目的 • 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； • 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； • 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。

4. 绪　论 • 二、通过生物化学实验应该做到 • 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 • 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 • 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 • 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。

5. 绪　论 • 三、实验室规则 • １、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退。 • ２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因；贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作；发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。仪器使用完毕后，一定要填写使用记录。

6. 绪　论 • ３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放。 • ４、注意安全。对于有毒、腐蚀的试剂应避免其直接接触人体及衣物；乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。 • ５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔。实验结束后应将实验台整理好，并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗，方可离开实验室。

7. 绪　论 • 四 、实验须知 • １、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确学习目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。 • ２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，杜绝弄虚作假。 • ３、实验结束后，将实验原始数据填写到实验报告册中的原始数据栏，并当场交给老师批阅。回去后要认真书写实验报告，及时交老师批阅。

8. 绪　论—五 实验记录与实验报告 1、 实验记录 • 实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。 • 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。(直接填写到实验报告册的原始数据栏） • 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。所有数据都应如实记录，不得随意涂改。 • 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。 • 杜绝一切抄袭和弄虚作假现象，一旦发现后果自负。

9. 绪　论—五 实验记录与实验报告 • 2、实验报告 • 实验预习报告包括如下内容： ①实验项目名称；②详细实验目的、原理；③实验操作步骤； ④注意事项。 • 实验报告包括如下内容：①实验项目名称；②简写实验目的、原理；③实验结果； ④ 分析与讨论；⑤注意事项等。

10. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 一、目的 • 了解激活剂和抑制剂以及pH值对酶活力的影响，掌握淀粉酶活性鉴定的方法。

11. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 二、原理（一） • 酶活力与环境pH值有密切关系。通常各种酶只有在一定pH范围内才有活力。酶活力最高时的pH称为该酶的最适pH，低于或高于该pH，酶的活力逐渐降低。 • 本实验通过磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的不同配比调制出不同的pH，将淀粉与酶相混，淀粉被水解，遇碘不显蓝色，酶活力强，需时短，说明该环境pH是酶比较适应的，反之，则说明环境pH是酶不太适应的。根据试液颜色褪去时间的长短，推断出试验酶的最适pH。

12. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 二、原理（二） • 酶的活性受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为激活剂；而另一些物质则降低酶的活性，称为抑制剂。 • Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。而为 抑制剂。将淀粉与酶相混，作用一段时间后，淀粉被水解，遇碘不显蓝色，酶活力强，需时短，酶活力弱，需时长，故可用反应时间表示酶活力的强弱。 Cu2+

13. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 四、实验器材 • 1、0.2mol/L的Na2HPO4 • 2、 0.2mol/L的NaH2PO4 • 3、1%淀粉液:称取可溶性淀粉1g,先用少量水加热调成糊状,再加热水稀释至100ml. • 4、1%的氯化钠溶液:1gNaCl溶于100ml 蒸馏水 • 5、1%硫酸铜溶液:1gCuSo4溶于100ml 蒸馏水 • 6、稀碘液：于2%碘化钾溶液中加入碘至淡黄色。

14. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 五、操作 • 取干净试管5只，表1（见书167页）加入试液，加入酶后，迅速混匀，置37℃水浴保温，每隔1min从3号管中去溶液2滴加到已有碘化钾-碘试剂的白磁盘中，观察颜色变化你，直至碘不显色时，再向各管加碘化钾-碘试剂2滴，摇匀后观察。根据实验结果找出唾液淀粉酶的最适pH.

15. 0.1%淀粉液 /ml 1%的氯化钠溶液/ml 1%硫酸铜溶液 /ml H2O/ml 1：30唾液/ml 1 2.0 1.0 --- --- 1.0 2 2.0 ---- 1.0 -- 1.0 3 2.0 ---- ---- 1.0 1.0 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 五、操作 • 取试管3支，按表2编号并加入试剂。加毕，摇匀，同时置40℃水浴保温，每隔2min取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，哪支管液最先不呈现蓝色，哪支管次之，说明原因。 试剂 管号

16. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 六、实验注意事项 • 1、实验过程中试剂取量一定要保证一致性，同时一定要认真观察实验现象，不能漏过实验颜色的变化点。 • 2、要正确找到反应终点，并记下相应反应时间。 • 3、要在预热2min后加入唾液，并在加入唾液后马上记时。

17. 实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响 • 六、实验注意事项 • 5、实验中一定要保留一份没有加入酶液的空白对照，以便于比对颜色变化 • 6、各管试剂加入后，一定要迅速充分混匀再进行试验检测。

18. 实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 一、目的和要求 • 1. 了解并初步掌握吸附层析的原理。 • 2. 学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法。 • 3.学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，并学会简易薄板的制作

19. 实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 二、原理 • 1、植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可获得较纯的可溶性糖混合物。

20. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 二、原理 • 2、薄层层析是层析法的一种，层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理，化学差别，使各组分以不同程度分布在两个“相”中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相； • 当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同，或吸附性质不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同速度前进，从而达到分离的目的。

21. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 二、原理 • 3、薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法。 • 本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂（如硅胶粉），层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。

22. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 二、原理 • 4、糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。 • 硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来。 • 一般吸附力的大小为：三糖>双糖>己糖>戊糖。其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。通过与标准糖的Rf值比较。即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。

23. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 二、原理 • 5、Rf计算公式： • 溶质斑点中心到样点的距离 • Rf( 值) = 溶剂前沿到点样点的距离

24. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 三、实验材料、仪器和试剂 • 1．材料：苹果或其他植物材料 • 2．仪器： （1）离心机及离心管 （2）天平 （3）研钵（4）量筒25ml （5）移液管10ml （6）恒温水浴 （7）毛细管（8）层析缸 （9）吹风机（10）玻璃板：7×15cm （11）烘箱（12）喷雾器 （13）烧杯50ml,100ml 铅笔、尺子

25. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 三、实验材料、仪器和试剂 • 3．试剂 • （1）无水酒精 • （2）氯仿：冰醋酸：水，配比为30：35：5 • （3）1％标准糖溶液（10mg/ml）：木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖等。 • （4）苯胺－二苯胺－磷酸显色剂：2克二苯胺，加2ml苯胺，10ml 85％磷酸，1ml浓HCl，100ml丙酮，溶后摇匀。 • （5）0.1M硼酸溶液

26. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 四、操作 • 1.水果中可溶性糖提取液的制备 • 1.1 取洗净的苹果（或其他水果）削去果皮，称8g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在四层洗净的纱布上。包起置于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。 • 1.2取果汁2ml于离心管中，加无水乙醇6ml，充分混匀后，在3000转／分下离心20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。

27. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 四、操作 • 2.苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定 • 2.1点样 取活化后的硅胶G板一块，距底边1.5厘米水平线上确定4个点，相互间隔1厘米，其中3个点，分别点上5％的木糖、葡萄糖、蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴，一般点4次。 • 2.2 展层 以氯仿：冰醋酸：水展层剂上行展层，当展层前沿达距薄板顶端1.0厘米左右处，取出玻板用吹风机吹干。 • 2.3 染色 以苯胺－二苯胺－磷酸显色剂喷雾，于85℃烘箱中10分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，观察各点的颜色。 • 2.4 计算 根据斑点颜色及Rf值即可初步鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。

28. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 四、操作 • 3．板的制备： • 3.1 玻璃板须表面平整、光滑、清洁。用洗涤液浸泡，洗净，晾干，否则吸附剂容易剥落。 • 3.2 取硅胶G粉2克，加0.1M硼酸溶液4.5ml于研钵中充分研磨成糊状时，倾倒在薄板上，然后用手轻轻倾斜玻璃板，使糊状吸附剂在整块板上分布均匀，表面平坦光滑。 • 3.3 将制好的薄板置于水平台上自然晾干后，用前于110℃烘箱中活化一小时使用。

29. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 五、实验注意事项 • 1、薄板制备过程中，一定要保证玻璃板干净、干燥且无油渍 • 2、薄板制备过程中，加硼酸搅拌及研磨一定要快，要研磨均匀，一般研磨到发出如脂肪光泽时，且要有一定的流动性，立即涂匀为最好 • 3、铺好板后，要在水平台上自然晾干，用前于110℃烘箱中活化一小时（时间计算从达110℃开始），但活化时要在低温（60℃左右）时就将板放进烘箱，防止因骤然升温导致硅胶板脱落。

30. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 五、实验注意事项 • 4、在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶G板的方向点样，而且毛细管接触G板的时间应尽量短，点样斑点直径一般不宜超过3mm。 • 5、在确定点样位置时，只需在板上轻轻一点，决不能点得过深，且不能用油笔或钢笔点。样点位置一定要高于展层剂层面。 • 6、点样时，要等前一次的样点干燥后，再点下一次，一般每个样点点4次。

31. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 五、实验注意事项 • 7、在进行展层前，要先在层析缸中加入一些层析剂，使整个缸内充满层析剂，以使样品能在一个稳定的环境中进行展层。 • 8、在展层好后，立即用尺量出溶剂前沿距离，不要等到吹干后再量。 • 9、在用吹风机吹干时要注意用小风吹，或者将吹风机离板较远点吹。

32. 实验二、 、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定 • 五、实验注意事项 • 10、染色完成后，放置于烘箱85℃烘时，若烘了10min后有些点还是不显色，可以在记录已显色点的颜色和距离后，继续烘，直至显色为止。 • 11、为了使实验现象明显，提取糖时，宜使糖的浓度高一些。

33. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 一、目的 • 通过实验要求学会装柱、洗脱、收集等离子交换层析技术

34. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 二、原理 • 树脂（惰性支持物）结合了阳离子或阴离子后，可与阳离子或阴离子结合。改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。 • 由于不同的氨基酸在不同的pH值及离子强度溶液中所带的电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同,对阳离子树脂而言，氨基酸的pI值越高，对阳离子交换树脂的亲和力越强， 洗脱速度越慢。从而可以在洗脱过程中按先后顺序洗出，达到分离的目的。

35. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 三、实验器材 • 1、层析柱（带加压装置） • 2、刻度试管（试管架）10ml以上15支 • 3、烧杯250ml 1支 • 4、吸管1.0ml和5.0ml

36. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 四、实验试剂 • 1、732型阳离子树脂 • 2、柠檬酸缓冲液（0.45mol/L，pH5.3） • 3、显色剂（0.5%茚三酮） • 4、0.1CuSO4溶液 • 5、氨基酸样品：0.005mol/L的Asp和Lys（用0.02mol/LHCl配制）

37. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 五、操作 • 1、树脂预处理 • 干树脂经蒸馏水膨胀，倾去小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L的HCl及2mol/L的NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。在用1mol/L的NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。

38. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 五、操作 • 2、装柱（湿装法） • 垂直装好层析柱，关闭出口，在柱子底部加一棉花团，加入柠檬酸缓冲液约1cm高。将处理好的树脂加等体积缓冲液，搅匀，沿管内壁缓慢加入，柱底沉积约1cm高时，缓慢打开出口，继续加入树脂，直至8cm高(小柱可装至12cm)。 • 装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。

39. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 五、操作 • 3、平衡 • 将3倍柱床体积（约50ml）的缓冲液按1ml/min的速度进行平衡，直至树脂表面约1.5mm高液面时，关闭旋纽。 • 4、上样（加样） • 沿管壁接近液面处加入0.5ml样品，慢慢打开出口，使液面降至与树脂表面相平时关闭旋纽。吸少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至4cm高。 • 5、洗脱（接上步骤打开旋纽） • 以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速，0.5ml/min，用试管架上的试管依次接收，每管接收5ml，接15管。

40. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 五、操作 • 6、测定 • 分别取各管洗脱液1ml，各加入显色剂1ml，混合后沸水浴5min，冷却，各加0.1%CuSO4溶液3ml，混匀，测A570nm。以A值为纵坐标洗脱液累计体积（5ml为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线。

41. 实验三 离子交换柱层析分离氨基酸 • 六、实验注意事项 • 1、树脂预处理要严格操作，特别是转型一定要充分。 • 2、装柱前在柱子底部加一棉花球。 • 3、装柱时，边加树脂边用木质棒（或橡胶棒）轻敲柱子，使基质缓缓下沉 。 • 4、装柱要求连续、均匀、无纹格、无气泡，表面平整，整个层析过程中液面一定不得低于树脂表面。 • 5、要注意及时开启和关闭旋纽。 • 6、要注意控制流速，不宜过快。 • 7、在加入好样品后（在洗壁前）就要接收洗脱液。 • 8、测定A值时，一定要用空比色杯调吸光度零点。

42. 实验四 维生素C的定量测定

43. 一、实验目的： • 掌握Vc提取和定量方法 • 学会计算Vc的含量

44. 二、实验原理： • (1)维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸。维生素C具有很强的还原性。 • (2)在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，抗坏血酸易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将染料2，6—二氯酚靛酚还原成无色的还原型2，6—二氯酚靛酚。同时将抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸。

45. 氧化型的2，6—二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。氧化型的2，6—二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。 • 因此，当用2，6—二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部被氧化时，滴下的2，6—二氯酚靛酚立即被还原成无色。但溶液中的抗坏血酸一旦被氧化完时，则滴下的2，6—二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。 • 所以，当溶液从无色转变成微红色时，即表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定标淮溶液时2，6—二氯酚靛酚的消耗量，可以计算出被检物质中抗坏血酸的含量。

46. 实验原理如下图：

47. 该法简便易行，但有下列缺点： • 在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在。它们同样地具有维生素C的生理作用，但不能将2，6—二氯酚靛酚还原脱色。 • 生物组织提取物和生物体液中常合有其他还原性物质，其中有些也可在同样实验条件下使2，6—二氯酚靛酚还原脱色。 • 在生物组织提取物中，常有色素类物质存在，给滴定终点的观察造成困难。

48. 三、实验器材 1、猕猴桃100g 2、吸管1.0ml、10.0ml 3、容量瓶1000ml 4、电子分析天平 5、研钵 6、漏斗

49. 四、实验试剂 • 2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸馏水中 • 1%草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸馏水中 • 标准抗坏血酸溶液（0.1mg／ml）:准确称取50.0mg纯抗坏血酸,溶于1%草酸溶液,并稀释至500ml.贮于棕色瓶中,冷藏,最好临用时配置. • 0.1% 2，6—二氯酚靛酚溶液：溶500mg 2，6—二氯酚靛酚于300ml含有104mlNaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至500ml，滤去不溶物贮棕色瓶内，冷藏。

50. 五、实验操作： 研磨时为什么要加2%的草酸？ • 1、样液制备 称取100克猕猴桃，放入研钵中，加入适量2%草酸研磨成匀浆，将匀浆转入1000ml容量瓶，用草酸定容至1000ml，并混匀，抽滤，滤液备用。