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Biosenseurs ATR

Biosenseurs. ATR et biosenseurs BIA-ATR. Biosenseurs ATR. Information sur les molécules. Pour les échantillons biologiques principalement composés de protéines, lipides, glucides et acides nucléiques:.

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Biosenseurs ATR

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Presentation Transcript

  1. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Biosenseurs ATR

  2. Information sur les molécules Pour les échantillons biologiques principalement composés de protéines, lipides, glucides et acides nucléiques: Spectres FTIR du glucose (à gauche) et du sérum (à droite). Le premier spectre peut être utilisé pour étudier les absorptions caractéristiques du glucose (spectre de produit pur); la bande centrée à 1033 cm-1 est utilisée pour déterminer la concentration de glucose.

  3. Information sur la conformation Le spectre infrarouge d’une protéine [-(C=O)-NH-] Amide I: (C=0) Amide II:  (N-H) Amide A: (N-H)

  4. Information sur la conformation -helix -sheet -helix Le spectre infrarouge et structure secondaire

  5. Information on conformation Protein secondary structure: building of a protein database Spectrum # cm-1

  6. Identification de lignées cellulaires (bactéries, cellules eucaryotes) • Typage de cancers • Mesure de la structure secondaire de protéines •  signature unique des molécules en présence

  7. La réflexion totale atténuée (ATR) Ge plates ATR et transmission

  8. La réflexion totale atténuée

  9. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Biosenseur non covalent:phosphorylation de l’ATPase gastrique

  10. The ATR flow cell Flow chamber Protein film Germanium ATR crystal IR beam

  11. Adenosine 5¢-(b,g-imido)triphosphate tetralithium salt hydrate AMP-PNP MgATP ref. MgATP MgATPS AMP-PNP ATPase phosphorylation: flow experiment- ATP derivatives Phosphorylated enzyme (see acetyl phosphate)

  12. E1 – E2 conformational change: flow experiment K+ conditions - Na+ conditions (72 spectra) Control: same, with Ca++ present in both the Na+ and the K+ conditions *: Student, <1%

  13. More α-helix condition K - Na Less β-sheet Change of the secondary structure E1 – E2 conformational change: flow experiment

  14. E1 – E2 conformational change: flow experiment Specificity of the changes K - Na CaK - CaNa CaATP - Ca

  15. E1-E2: structure change? caged-ATP Trace A: difference infrared spectrum obtained after release of ATP from its precursor (3.3mM caged ATP) in the presence of H+,K+-ATPase (13mg/ml) in 2H2O buffer (100mM Tris/HCl p2H 7.6, 5mM CaCl2) Trace B:id, caged ADPTrace C:id, caged Pi

  16. Conclusions The method is sensitive Only a couple of residues experience a secondary structure change in the E1-E2 transition and upon phosphorylation One or two acidic residues are deprotonated in the upon phosphorylation

  17. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Biosenseur covalent

  18. Principe du chip senseur polyvalent

  19. La géométrie « Toblerone » 4.8x4.8x45 mm Purity>99.999% Resistivity 5-40 /cm

  20. hυ hυ Récepteur (D) Récepteur (D) Clip photoactivable (C) Clip photoactivable (C) Clip photoactivable (C) Couche organique primaire (B) Couche organique primaire (B) Couche organique primaire (B) LE BIOSENSEUR DE LA VANCOMYCINE Construction du chip activé NHS Ge oxydé (A)

  21. La couverture organique : Stratégie

  22. Biosenseurs, en pratique • Toblerone • multipiste

  23. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Le couple streptavidine - biotine

  24. The membrane is bound:Binding of streptavidine on PE-biotine • Binding of streptavidine • on PE-biotine film

  25. Biosenseurs *10-3 ATR et biosenseurs BIA-ATR: spécificité x10-3 Streptavidine HSA

  26. Biosenseurs Temps ATR et biosenseurs BIA-ATR Suivi par FTIR de la fixation de la streptavidine sur le senseur A : Amide I band (1634.7 cm-1) B : Amide II band (1543.4 cm-1) A B

  27. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Détection d’un peptide court se fixant sur un anticorps

  28. MAB 1 MAB 2 MAB 3 3 anticorps de souris: Peptide Introduction: BUT: Mettre en évidence la fixation d’un court peptide (env 20 résidus) sur le MAB.

  29. Phase liquide mobile : solvant + ligands en solution Peptide MAB RAM PEG Germanium Faisceau réfléchi Elément optique Réflexions multiples Faisceau incident Détection i nfra -rouge conduisant à des informations quantitatives concernant : quantité - la de ligands fixés nature - la des ligands transitions - les Récepteurs conformationnelles immobilisés à la surface du biosenseur Méthodes directes Méthodes indirectes Ligands : ou Récepteurs primair es ou secondaires : Molécules liantes : • Construction du senseur: • Préparation senseur germanium PEG-ester activé • fixation (covalente)= rabbit antimouse (RAM) • fixation MAB sur RAM • fixation du peptide sur MAB

  30. Fixation du RAM (rabbit anti-mouse) sur le cristal: 10’ 6’ 3’ T 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 0 MAB 2) Fixation de MAB sur RAM: x 10-3

  31. 3) Fixation du Peptide sur MAB: x 10-3 10’ 6’ T 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 0 Peptide

  32. Contrôle: fixation du Peptide sur RAM: x 10-3 10’ 6’ 3’ T 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 0 Peptide

  33. Régénération: Moyenne des pics Amide I, II après fixation de MAB Moyenne des pics Amide I,II après passage de la solution glycine pH 1.5

  34. Biosenseurs ATR et biosenseurs BIA-ATR Ligands de l’ATPase gastrique

  35. Rabeprazole binding: Cys 822

  36. Rabéprazole 1. Liaison à la H+,K+-ATPase gastrique Spectre de référence du rabéprazole Modification spectrale [mesures avec ATP, contrôles sans ATP non montrés] *: Student, <1%

  37. Rabéprazole 2. Réaction chimique avec la H+,K+-ATPase gastrique Spectre de référence du rabéprazole Modification spectrale [mesures avec ATP, contrôles sans ATP non montrés]

  38. Wash MgATP T=35°C ATPase phosphorylation Time cm-1

  39. cm-1 Time (min)

  40. Détection de la vancomycine par le peptide Lys-D-Ala-D-Ala

  41. Récepteur D-Ala-D-Ala

  42. 4- Vancomycin biosensor Building of the sensor

  43. Am I Am II (C-O) (C=O) PBS O O O M e O G e O S i N O 7 H O O N H N G e - P E G S D - N H S O O Fixation du récepteur Lys-D-Ala-D-Ala Amide I: 1640 cm-1 Amide II: 1558 cm-1 Groupe partant: 1720 et 1260 cm-1

  44. 4- Vancomycin biosensor D-Ala-D-Ala binding Leaving group with C=O and C-O bonds New groups with amide bonds

  45. La vancomycine

  46. Liaison de la vancomycine 1230 cm-1 - fixation suivie par un pic caractéristique présent à 1230 cm-1 - ce pic n’est pas superposé à d'autres bandes intenses de la solution ou du récepteur. - mesure de la fixation de la vancomycine par l’intensité de ce pic. 200µg/ml 100µg/ml 50µg/ml 20µg/ml 10µg/ml 5µg/ml 1µg/ml 0.5µg/ml 0 Série de spectres enregistrés en fonction de la concentration en vancomycine

  47. Liaison de la vancomycine: effet des sels • fixation de la vancomycine instable en présence de tampon ou de sel • problème potentiel pour la mesure dans des conditions cliniques • → détermination d’un tampon optimal pour la microdialyse

  48. Détection de la vancomycine dans le glucose 5%: validation 3 répétitions, 3 jours différents

  49. Détection de la vancomycine par un anticorps spécifique

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