slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
实验十七 ( 2 )烟草原生质体融合 PowerPoint Presentation
Download Presentation
实验十七 ( 2 )烟草原生质体融合

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 9

实验十七 ( 2 )烟草原生质体融合 - PowerPoint PPT Presentation


  • 228 Views
  • Uploaded on

实验十七 ( 2 )烟草原生质体融合. 一、原理 PEG 带微弱极性的负电荷,能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用,加上 PEG 渗透吸水的作用,使原生质体相互接触在一起。 在洗涤过程中,直接或间接与质膜结合的 PEG 分子从原生质体表面洗脱,并随着 pH 的降低,导致膜电荷的不平衡和发生重新分布;在原生质体 吸水过程中,发生原生质体融合。. 二、实验目的. 学习植物原生质体融合的方法,为进行体细胞杂交,培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。. 三、实验材料和用具

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about '实验十七 ( 2 )烟草原生质体融合' - beatrice-waters


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

实验十七

(2)烟草原生质体融合

一、原理

PEG带微弱极性的负电荷,能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用,加上PEG渗透吸水的作用,使原生质体相互接触在一起。

在洗涤过程中,直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱,并随着pH的降低,导致膜电荷的不平衡和发生重新分布;在原生质体 吸水过程中,发生原生质体融合。

slide2

二、实验目的

学习植物原生质体融合的方法,为进行体细胞杂交,培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。

三、实验材料和用具

1、材料:烟草BY2愈伤组织,烟草组培苗

2、用具:过滤器,注射筒,不锈钢网筛(=54m),漏斗,三角瓶,滴管,10ml刻度离心管,血球记数板。

slide3

四、实验步骤

1、配制酶液

各组(2人)配制下列酶液各10ml, 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。

CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶+0.5%离析酶

slide4

2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离

黑暗、 25℃酶解5~6小时,间歇轻轻摇动。

2~3周龄愈伤组织和叶片各约1g和0.5g,叶片剪成细条

加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织

slide5

3、过滤和离心洗涤原生质体

800rpm离心3min

过滤

弃上清液

弃上清液,重新悬浮在0.5ml CPW溶液中

800rpm离心3min

加入3ml CPW培养基,用滴管重新悬浮原生质体

slide6

4、原生质体融合

(1)调整密度:用血球板计数后,将原生质体的密度调整为106个原生质体/ml。

(2)配置PEG融合液(无菌下)

PEG溶液:甘氨酸缓冲液:DMSO=8:1:1

(3)将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体积混合。

slide7

(4)原生质体融合步骤

5min内缓慢加入5ml W5稀释液,轻轻吸打混匀

取0.2ml混合原生质体悬浮液

加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液

静置10min

重新悬浮在0.5ml W5,静置>10min

800rpm离心3min,弃上清夜

静置>30min

slide8

(5)融合原生质体的观察

吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数板上,在显微镜下融合的原生质体,统计融合率。

融合原生质体的特征:

A:异源融合;B:同源融合

融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数

slide9

准备下次实验的试剂(各100ml):

(1)2×CTAB提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),2%(w/v)CTAB,1.4M NaCl,40mM -巯基乙醇,20mM EDTA

(2)TE缓冲液:10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。

(3)50TAE电极缓冲液:称取24.2gTris溶解于适量蒸馏水中,加入5.7ml冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶液,定容到100ml。

(4)溶液I:50 mmol/L葡萄糖,25 mmol/L Tris.HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0)

(5)溶液III: 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5%冰乙酸 , 28.5 ml无菌水

(6)分别配制0.4 mol/L NaOH和2%SDS溶液(各50ml)