抗间日疟原虫 GDH 特异性 单抗的大量制备及纯化

1. 抗间日疟原虫GDH特异性单抗的大量制备及纯化 主讲人：江云

2. 背景 • 疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病，全球广泛流行，我国也深受其害，发病以间日疟为主，虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划，但本世纪前十年曾经出现中部间日疟疫情回升，表明疟疾控制态势仍然脆弱。间日疟原虫感染病例血液中的原虫密度通常较低，由于漏诊病例有可能成为当地传播的潜在传染源，因此，及时有效地发现病例，无论是在疟疾控制阶段，还是疟疾消除进程中，都具有十分重要的意义。

3. 显微镜血涂片检查是经典疟疾诊断实验，不但需要器材，操作费时费力，检测结果很大程度上依赖于镜检人员的经验和责任心，在疟疾低流行区漏检率高，已不能满足当前疟疾消除的高要求。近年来，基于免疫层析的疟疾快速诊断技术（Rapid Diagnostic Tests, RDTs）发展较快，因其特异性和敏感性均较高，无需仪器设备，操作简单，结果易判读，实施较为方便，非常适合疟疾现场应用，然而，迄今为止，仍无适合间日疟诊断的RDT可用，主要原因在于缺少敏感度高，特异性强的间日疟原虫靶抗原，由于我国以间日疟流行为主，迫切需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。

4. 间日疟原虫（Plasmodium vivax, P.v）的体外培养技术尚不成熟，难以提供大量实验材料，从感染者采集的血样，其疟原虫密度低，且含有难以去除的宿主白细胞，因此，高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难，已成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过基因重组表达制备的蛋白纯度高，抗原性和天然蛋白类似，可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途径之一。

5. 有研究表明，疟原虫谷氨酸脱氢酶GDH具有独特的理化，生物学及酶学特性，而且宿主红细胞内没有此酶，从而成为指示疟原虫感染的标志物。GDH是一种普遍存在于生物体内对碳和氮代谢起重要作用的酶，在疟原虫整个红细胞内期均能表达，它催化谷氨酸脱氨基生成酮戊二酸， 同时使辅酶I和II，由氧化型NAD和NADP转化为还原型NADH和NADPH。 • 疟原虫GDH是NADPH生成的主要来源，而且更为重要的是，宿主红细胞内没有此酶（GDH-NADPPH）。因此该酶有望成为疟疾快速诊断的新型候选分子。

6. 实验方法 • 1.杂交瘤细胞的复苏与培养 从液氮中取出的细胞冰存管，置于37摄氏度水中融化，至仍有少量冰存在时，吸取细胞加至已装有适量1640培养基的进口瓶中，放入恒温二氧化碳细胞培养箱内。第三天，选取生长良好的一瓶，将培养液全部倒出，再加入适量新配制的1640培养液，继续放入细胞培养箱中培养，重复此步，直至镜下观察细胞贴满瓶壁。

7. 2.抗间日疟原虫GDH蛋白的杂交瘤细胞体内腹水培养2.抗间日疟原虫GDH蛋白的杂交瘤细胞体内腹水培养 • 用注射器吸取5ML的吹打混匀的细胞培养悬液，注入10天前预先注射过石蜡油的小鼠腹部，正常饲养两周，选出腹部明显隆起的小鼠，将其处死固定于超净台上，小鼠用75%酒精浸泡1min，用无菌眼科剪小心剪开腹壁皮肤和肌肉，完全暴露腹膜，用装有适量肝素的5ML的一次性注射器将腹水迅速吸至细胞离心管中，立即摇匀以防凝集。

8. 3. Protein G-琼脂糖亲和层析法纯化小鼠单抗 • Protein G蛋白G能够和小鼠IgG的各个亚类均能发生结合，因而将Protein G固定结合于琼脂糖珠颗粒上，形成固相吸附相，当含单抗的小鼠腹水或杂交瘤上清通过含有Protein G-琼脂糖珠的层析柱，单抗被特异性结合到柱子上，经过洗涤去除非特异性结合的杂蛋白，再通过洗脱而获得纯化的单抗IgG蛋白。

9. 取小鼠新鲜制备的腹水，经4000rpm离心30分钟，以去除脂类等杂质。取透明的腹水液体加入等量的0.15M 的PBS混匀，再加入两倍于腹水体积的饱和硫酸铵溶液，于40C的冰箱内放置2小时，然后经4000rpm离心30分钟，吸弃上清，将沉淀用PBS稀释为原腹水体积的3倍量，按1ml/min缓慢通过层析柱（柱床体积为1ml），然后用10个柱体积的PBS通过柱子以充分洗涤去除柱子内残留的杂蛋白。再用10倍于床体积的0.1M 甘氨酸-HCl通过层析柱，分管收集，每管收集1ml，测定各管的蛋白浓度，合并蛋白含量高的收集管，经上述的超滤管离心浓缩，经考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度，于-200C冻存备用。

10. 4.纯化的抗间日疟原虫GDH单抗的纯度鉴定—SDS-PAGE电泳4.纯化的抗间日疟原虫GDH单抗的纯度鉴定—SDS-PAGE电泳 • 1．安装夹心式垂直板电泳槽 • 2．分离胶制备：按表配制20ml 15%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。

11. 3.浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。

12. 4.样品蛋白用样品溶解液溶解，沸水浴加热5分钟，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，开始电泳4.样品蛋白用样品溶解液溶解，沸水浴加热5分钟，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，开始电泳 • 5. 当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 • 6．染色及脱色。将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。

13. 结果 • 培养7天的细胞，数量较少

14. 培养14天的杂交瘤细胞，大量紧贴瓶壁，细胞形状规则，生长状况良好。培养14天的杂交瘤细胞，大量紧贴瓶壁，细胞形状规则，生长状况良好。

15. 图3.亲和层析法纯化抗间日疟原虫pvGDH蛋白特异单抗的SDS-PAGE电泳图3.亲和层析法纯化抗间日疟原虫pvGDH蛋白特异单抗的SDS-PAGE电泳 • M: 标准蛋白marker • 1-2: 抗pvGDH蛋白的单抗（克隆号：4A3F8） • （单抗的重链分子量为50kd，其轻链分子量为26kd）

16. 讨论 • 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。本实验采用的冻存液为甘油。

17. 冻存细胞比较脆弱，要求轻柔操作。细胞复苏时速要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。由于本实验采用的杂交瘤细胞对冻存剂(甘油)不敏感，未离心去除冻存培养基，冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。本次细胞培养的实验结果较为理想，获得了大量的杂交瘤细胞，细胞复苏后的培养较为关键。冻存细胞比较脆弱，要求轻柔操作。细胞复苏时速要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。由于本实验采用的杂交瘤细胞对冻存剂(甘油)不敏感，未离心去除冻存培养基，冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。本次细胞培养的实验结果较为理想，获得了大量的杂交瘤细胞，细胞复苏后的培养较为关键。

18. 寻找一种快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是当今疟疾防治研究工作中迫切需要解决的问题之一。间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）是疟原虫物质和能量代谢过程中十分重要的功能分子,在疟原虫整个红内期均能表达,更为重要的是宿主红细胞内没有此酶，应用杂交瘤技术制备了抗GDH单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研制打下基础。寻找一种快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是当今疟疾防治研究工作中迫切需要解决的问题之一。间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）是疟原虫物质和能量代谢过程中十分重要的功能分子,在疟原虫整个红内期均能表达,更为重要的是宿主红细胞内没有此酶，应用杂交瘤技术制备了抗GDH单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研制打下基础。

19. 结论 • 应用杂交瘤技术制备并纯化了抗GDH单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研制打下了基础。

20. 谢谢