利用甘藷抗蟲基因研發轉基因抗蟲蔬菜

1. (B) (A) sporamin sporamin RB RB NOS-pro NOS-ter NOS-pro NOS-ter 小菜蛾 A B 未處理(CK) NOS-ter LB 施藥後,死亡蟲體 NPT II NPT II NPT II CaMV 35S Pspoa Pspoa (C) 3’-flanking region sporamin NOS-ter LB RB NOS-pro NOS-ter C D E F G H NOS-ter LB 2005年台北生技獎 產學合作獎金牌獎 國立台灣大學植物科學所 葉開溫教授 前言 十字花科蔬菜長久以來一直是國人重要的蔬菜來源。在台灣，平均每年就有74萬噸的十字花科蔬菜產量，舉凡甘藍、小白菜、花椰菜等常見蔬菜皆屬十字花科蔬菜。然而，這些蔬菜在田間種植時容易遭昆蟲噬咬而影響其產量和品質，因此需要大量的農藥來防杜害蟲的侵襲。在這裡我們使用基因轉殖的技術，使植物本身能夠在遭受蟲害的時侯，適當地表現轉入的外緣抗蟲基因，因而減少蟲害能夠提高蔬菜的產值。 圖六 A、B：小規模田間試驗，轉殖芥蘭生長情形。其中未轉殖芥藍種植在不同轉殖株族群中，WT為野生株，Ⅰ為使用35S啟動子的的轉殖芥藍，Ⅱ為使用Pspoa啟動子的轉殖芥藍，Ⅲ為使用Pspoa啟動子伴隨一段MARs增進表現的轉殖芥藍。 C：使用35S啟動子的的轉殖芥藍仍會遭受昆蟲噬咬。 D、G：使用Pspoa啟動子的轉殖芥藍苗移到田間一個月及兩個月的生長情形。 E、H：使用Pspoa啟動子伴隨一段MARs增進表現的轉殖芥藍移到田間一個月及兩個月的生長情形。 F：未轉殖芥藍遭受昆蟲噬咬情形。 利用甘藷抗蟲基因研發轉基因抗蟲蔬菜 技術背景 在經過多年對甘藷sporamin基因的研究後，我們逐漸對這個基因有初步的了解。sporamin基因可以轉譯出具有胰蛋白脢抑制性的sporamin蛋白，在昆蟲攝入此蛋白後會抑制昆蟲消化液活性，使蟲體重量減輕，嚴重者甚致死亡(見圖一、 二)。 為了避免不同品系之間經由風力或蟲媒造成雜交，我們使用蕾期授粉及人工套袋方式進行純種保存，見圖七。然而，在不同植株間抗蟲能力良莠不齊，我們挑較完整的植株進行分析及保存，見圖八。 圖八 田間試驗中，挑選抗蟲能力優秀，植株性狀正常之轉殖株進行育種保存。 圖二 小菜蛾餵食sporamin後，因缺乏營養而死亡。 圖七 小型田間試驗，人工自花授粉操作情形。 圖一 玉米穗蟲餵食sporamin後，產生體重減輕、活力降低情形。 而此蛋白對熱敏感，加熱至80℃即可失活，故其食用上非常安全。然而，由於我們期望該基因能夠在遇到真正蟲害侵襲時才有表現，我們選用了來自甘藷sporamin基因上游約1.3 kb的啟動子Pspoa，它具有受傷誘導特性且反應快速(見圖三、四)，很適合用來驅動抗蟲基因表現，因此我們建構了含Pspoa驅動sporamin的載體以及35S promoter驅動sporamin的載體當做對照。我們也擔心個體間表現程度上的差異影響了抗蟲的能力，我們另外再加了sporamin基因3’-flanking region來幫助基因表現，它能增加基因的表現量及減少個體間表現量的差異，所以我們另外再設計了一組含3’-flanking region的載體來進行試驗(見圖五)。 技術移轉與專利申請 先前提到之技術「甘藷儲蛋白(sporamin)基因之抗蟲用途及利用基因之防治方法」已在九一年獲得台灣及美國核定之專利證明，見圖九。 圖九 左為美國核定之專利證，右為台灣核定之證明 在實驗室，我們利用組織培養技術建立了十字花科植物的再生系統，使基因轉殖得以順利完成。這裡感謝合作廠商興農公司資助興建組織培養室及相關器材添購。同時，興農公司也將 Pspoa 啟動子的應用技術在美國申請專利，目前已被美主管機關接受，待審核通過。至於後續的產學合作細節則尚在討論中。 圖三 Pspoa驅動gus基因，在菸草體內的表現情形。右上角為未受傷葉片，其餘為經受傷處理之葉片；在受傷反應下 Pspoa驅使gus大量表現，葉片經染色成為藍色。 圖四 Pspoa能使gus基因在受傷反應三十分鐘內達到最高表現量，且穩定持久。 未來發展 我們期待利用此基因衍生的轉殖技術能被推廣使用，甚至應用在其他在其他作物，如蕃茄等。在台中農改場，他們也應用相關的技術證明了sporamin可以幫助菊花抵抗斜蚊夜盜蟲的侵襲，見圖十。我們相信在台灣如能將此GMO產物商品化並廣泛使用，必能提高產品品質及產量，增加農產品的國際競爭力，同時也減少農藥對台灣土地的汙染及對台灣人民健康的危害。 圖五 三種不同功能的轉基因載體(A)具持續表現能力的35S promoter 驅動抗蟲基因；(B)具調控能力的 prospoa promoter驅動抗蟲基因；(C)具調控能力的 prospoa promoter加上增強基因表現的3’-flanking region 驅動抗蟲基因 將建構完成的載體經由農桿菌感染培植體的方法，使培植體帶有欲轉入的基因片段，再經過誘發癒傷組織、誘發上部組織、誘發下部組織等程序，最後長成整株植物。我們使用芥藍菜當材料，完成整個基因轉殖程序後是謂T1世代轉基因芥藍，經過活性分析後確定外來基因能在體內表達，再將它實際的放在田間做測試，見圖六。 圖十 以三齡之斜紋夜盜蟲進行生物測試，對照組（左）已被啃食殆盡，但轉殖菊花植株僅有部份咬痕（右）。