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  1. DAL DNA ALLE PROTEINEla trascrizione genica

  2. Tratti della sequenza di DNA vengono trascritti in RNA

  3. Ogni gene può essere trascritto e tradotto con diversi gradi di efficienza

  4. Cosa è necessario per la trascrizione? • DNA stampo • RNA polimerasi • Ribonucleosidi Trifosfati: ATP, GTP, CTP, UTP

  5. I più comuni RNA: rRNA, mRNA e tRNA • Regolata da segnali di inizio e termine • Complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi

  6. Modello a “chela di granchio” dell’RNA polimerasi Viene copiata in RNA una sola elica di DNA : elica di senso o filamento stampo

  7. RNA complementare allo stampo è uguale al filamento codificante (al posto di T c’è U)

  8. L’RNA pol batterica: 4 subunità a cui si associano: • fattore :per riconoscere l’inizio • fattore ρ che riconosce i segnali di terminazione

  9. Promotori sequenza all’inizio del gene • La subunità  associata a RNA pol riconosce il promotore, stabilisce la direzione della trascrizione • RNA pol trascrive la catena di senso

  10. L’ORIENTAMENTO del promotore determina quali tratti di DNA devono essere trascritti

  11. La doppia elica si apre e inizia la sintesi di RNA dal nucleotide +1 rispetto al promotore

  12. Ribonucleoside-PPP + RNAn= PP + RNAn+1 LEGAME FOSFODIESTRICO

  13. RNA cresce in direzione 5’-3’ • La trascrizione termina in sequenze del DNA ricche di CG • Può intervenire il fattore ρ: si lega alla RNA pol e permette il suo distacco dal DNA

  14. TERMINATORE RHO INDIPENDENTE

  15. TERMINATORE ρDIPENDENTE Attività ATPasica

  16. mRNA batterici • Pochi eventi di maturazione • Appena trascritti vengono tradotti • Alcune basi vengono metilate, piccola coda di rnt A

  17. Procarioti: controllo espressione genica Batteri: regolazione della trascrizione nella fase iniziale Più geni sotto controllo di un solo promotore Operone: tratto di DNA che contiene promotore, operatore e geni strutturali

  18. Operone lattosio • Il lattosio viene scisso in galattosio e glucosio da 3 enzimi • Gli enzimi vengono indotti solo in presenza di lattosio!!

  19. La cellula usa preferibilmente glucosio: lac spento • Quando non c’è glucosio si lega CAP • Quando non c’è lattosio si lega il repressore • Il lattosio agisce sul repressore e lo stacca

  20. OPERONE DEL TRIPTOFANO (TRP) La presenza di Trp fa legare il repressore e la trascrizione si blocca; viene prodotto Trp solo in caso di necessità

  21. Eucarioti RNA pol I rRNA RNA pol II mRNA, piccoli RNA nucleari, microRNA RNA pol III tRNA, piccoli RNA citoplasmatici Queste RNA pol riconoscono promotori diversi Promotori eucariotici più complessi di quelli procariotici NUMEROSE PROTEINE PARTECIPANO ALLO STADIO INIZIALE DELLA TRASCRIZIONE

  22. Eucarioti • RNA pol hanno bisogno di FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE: legame al promotore • TFIIA-B-D-E-F-H-J (per RNApol II)

  23. Promotori eucariotici • Es. RNA pol II: TATA box al -30/-25 e CAAT box al -80 • TATA è riconosciuta da TBP, una proteina componente di TFIID

  24. TBP riconosce TATA TBP+TAF= TFDII

  25. Sequenze di DNA (-200) legano attivatori (recruitment) della RNA pol II

  26. Gli attivatori legano il DNA e il complesso mediatore o direttamente il complesso di trascrizione

  27. Maturazione dell’mRNA eucariotico

  28. Procarioti: mRNA poligenico: presenza di più geni in una stessa unità trascrizionale • Eucarioti: mRNA monogenico, cioè prodotto di trascrizione di un singolo gene

  29. Maturazione mRNA eucariotico è complessa • 1- aggiunta del CAP al 5’: GMP con gruppo metilico • 2- taglio e coda di poli A (nucleotidi con adenina) al 3’ • 3- splicing • 4- editing

  30. CAP: protegge 5’ e favorisce l’inizio della traduzione Taglio e poli A: regolazione traduzione e stabilità di mRNA

  31. Il pre-mRNA è più lungo di mRNA maturo Lo SPLICING (taglia e cuci)permette di rimuovere gli introni

  32. Riconoscimento preciso dei punti di taglio introne-esone e di giunzione esone-esone

  33. Spliceosoma: snRNP, formate da piccoli RNA e proteine SnRNP U: U perché l’RNA è ricco di uridina

  34. SPLICING ALTERNATIVO Stesso trascritto primario, prodotti proteici diversi Combinazioni differenti di esoni Circa il 50% dei geni umani subisce splicing alternativo

  35. Splicing alternativo della tropomiosina nel muscolo striato e liscio

  36. Editing dell’RNA • Cambiamento dopo la trascrizione dell’mRNA • Addizione e/o delezione di residui di U in diversi siti della molecola, o cambiamento di molte U in C • Modificazione di C e A

  37. Gli mRNA vengono esportati nel citoplasma attraverso il complesso del poro nucleare Intervengono proteine per questo processo

  38. Regolazione della trascrizione negli eucarioti L’espressione dei geni eucariotici è controllata essenzialmente all’inizio della trascrizione, anche se può essere regolata in altri momenti

  39. Rapporto tra struttura della cromatina e trascrizione • DNA + ISTONI= nucleosomi • compattamento e de-compattamento della cromatina • I geni trascritti si trovano in zone di cromatina decondensata

  40. Modificazioni più comuni • Acetilazione istoni • Complessi rimodellatori della cromatina

  41. FOSFORILAZIONE METILAZIONE ACETILAZIONE CODICE ISTONICO

  42. Metilazione DNA • La metilazione: C del 2-7% delle coppie CG • Favorisce lo stato eterocromatico • Metilazione e imprinting genomico: l’espressione di alcuni geni è determinata dall’origine parentale

  43. Regolazione a livello post trascrizionale: i micro-RNA

  44. microRNA inibiscono traduzione mRNA • Molecole di RNA piccolissime: 18-25 nucleotidi • miRNA: presenti in tutti gli eucarioti, trascritti da RNApol II

  45. Meccanismo d’azione miRNA Complementarietà imperfetta: blocco traduzione mRNA Complementarietà perfetta: degradazione mRNA

  46. Pri-miRNA è convertito in pre-miRNA da Drosha (RNAasi) • Pre-miRNA è esportato nel citoplasma

  47. DICER (endonucleasi) converte Pre-miRNA in RNA a doppio filamento • Uno dei 2 filamenti è il mi-RNA e viene incorporato nel complesso RISC • Il mi-RNA riconosce un mRNA bersaglio e blocca la traduzione

  48. Il meccanismo dei miRNA è alla base dell’ interferenza da RNA indotta dai siRNA (Small interfering RNA) • I siRNA hanno un ruolo importante in alcuni meccanismi antivirali o di modellamento della cromatina • siRNA sintetici potrebbero avere applicazioni in ricerca e clinica

  49. RNA INDUCED SILENCING COMPLEX: RISC

  50. Molecole di siRNA derivano da lunghe molecole di RNA bicatenario prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula (virus) • RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma