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胶质瘤干 / 祖细胞 放射耐受机制的初步研究

胶质瘤干 / 祖细胞 放射耐受机制的初步研究. 董 军 黄 强 苏州大学附属第二医院神经外科. 治疗效果仍不满意！ ？. 放射治疗是胶质瘤患者重要的治疗手段，但绝大多数患者在照射野中复发，提示受照射的肿瘤细胞群体中有一小部分细胞能够耐受辐射，可能是肿瘤复发的根源. Singh 在 2003 年成功分离出了胶质瘤干细胞，并提出胶质瘤干细胞可能是决定胶质瘤发生、发展、恶性进展、复发以及对放化疗敏感与否的关键细胞. 胶质瘤干细胞可能是放射耐受的责任细胞 但其分子机制不明，有关文献报道可能与其 DNA 损伤修复能力强有关. 材料与方法.

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胶质瘤干 / 祖细胞 放射耐受机制的初步研究

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Presentation Transcript

  1. 胶质瘤干/祖细胞放射耐受机制的初步研究 董 军 黄 强 苏州大学附属第二医院神经外科

  2. 治疗效果仍不满意！？

  3. 放射治疗是胶质瘤患者重要的治疗手段，但绝大多数患者在照射野中复发，提示受照射的肿瘤细胞群体中有一小部分细胞能够耐受辐射，可能是肿瘤复发的根源 Singh在2003年成功分离出了胶质瘤干细胞，并提出胶质瘤干细胞可能是决定胶质瘤发生、发展、恶性进展、复发以及对放化疗敏感与否的关键细胞

  4. 胶质瘤干细胞可能是放射耐受的责任细胞 • 但其分子机制不明，有关文献报道可能与其DNA损伤修复能力强有关

  5. 材料与方法 • 人脑胶质瘤干/祖细胞系SU-2、SU-3为我实验室自建，人脑胶质瘤细胞株U-87MG、U-251购自ATCC • 细胞培养试剂：DMEM、DMEM+F12、FCS、B27、EGF、bFGF等 • PE标记小鼠抗人CD133流式试剂盒（Miltenyi Biotec）， FITC标记小鼠抗人Nestin流式试剂盒（R&D）， PE标记小鼠抗人GFAP流式试剂盒（Santa Cruz），细胞周期流式试剂盒（联科生物公司），凋亡流式试剂盒 （Invitrogen） • CD133引物、探针、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒 （ShineGene公司） • DNA损伤信号通路PCR芯片（Sabiosciences）

  6. 细胞培养 • 将上述4种细胞分别置于含10% FCS的DMEM 和无血清的 DMEM+F12基础培养基（含2% B27添加剂、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF）中培养，48～72h后倒置相差显微镜下观察细胞形态

  7. 流式细胞术检测CD133+细胞比例 • 流式细胞术检测Nestin+细胞比例 • 流式细胞术检测GFAP+细胞比例 • 流式细胞术检测细胞周期 • 流式细胞术检测细胞凋亡比例

  8. 将4种干细胞培养条件下的干细胞球通过直线加速器对细胞进行照射将4种干细胞培养条件下的干细胞球通过直线加速器对细胞进行照射 • 照射剂量分别为5Gy、10Gy、15 Gy，分别于照射后24h、48h、72h收集细胞，流式细胞术检测照射前后胶质瘤干/祖细胞中CD133+ 、Nestin+、GFAP+细胞比例变化及实时荧光定量PCR检测CD133基因表达变化 • 采用DNA损伤信号通路PCR芯片检测干细胞培养条件下U-87MG肿瘤干/祖细胞照射（10Gy,72h）前后相关基因表达水平变化

  9. 实时荧光定量PCR检测胶质瘤干细胞与分化状态的胶质瘤细胞中CD133基因表达水平变化实时荧光定量PCR检测胶质瘤干细胞与分化状态的胶质瘤细胞中CD133基因表达水平变化 • 试剂盒法抽提细胞的总RNA • 逆转录成cDNA • 加入相应的引物，按照Sybr Green I试剂盒说明，以及定量PCR仪器操作步骤，检测CD133拷贝数。 • 以人GAPDH 作为内参照，以同一份样品CD133拷贝数/GAPDH拷贝数表示该基因在样品中的表达水平

  10. CD133基因扩增引物 • hPROM1F AGAGGCGTTGGAGAACATGAAC • hPROM1R GCTAGTTTTCACGCTGGTCAGA • GAPDH基因引物序列 • GAPDH-F CCACTCCTCCACCTTTGAC • GAPDH-R ACCCTGTTGCTGTAGCCA

  11. 结 果

  12. U-87MG U-251 SU-2 SU-3 干细胞培养条件下肿瘤干细胞球与分化条件下细胞形态学比较 GCs (glioma cells)：分化条件下培养的胶质瘤细胞 GSPCs (glioma stem /progenitor cells)：干细胞培养条件下的胶质瘤干/祖细胞

  13. 两种培养条件下4株细胞中CD133、Nestin、GFAP+细胞比例检测两种培养条件下4株细胞中CD133、Nestin、GFAP+细胞比例检测

  14. 两种培养条件下细胞周期测定

  15. 两种培养条件下细胞周期测定

  16. 两种培养条件下4株细胞凋亡细胞比例的检测

  17. 两种培养条件下各细胞株中CD133基因表达水平测定两种培养条件下各细胞株中CD133基因表达水平测定

  18. 结果 • 干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中CD133+、Nestin+细胞比例及CD133基因表达水平均明显高于分化培养条件（P＜0.01），干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞球体中G0～G1期细胞比例高于分化条件下贴壁生长的瘤细胞，而凋亡细胞比例较后者为低 • 干细胞培养条件下，各胶质瘤细胞系中Nestin+细胞占绝大多数，CD133+细胞波动于1%～5%，提示干细胞培养条件下所获得的细胞球为干细胞和祖细胞的混合细胞群 • CD133+细胞比例越高，细胞球形态越规则、越致密、干性强

  19. 流式细胞术检测四株GSPCs 放射后CD133+细胞比例的变化

  20. 四株 GSPCs 放射后Nestin+细胞比例的变化

  21. 四株 GSPCs 放射后GFAP+细胞比例变化

  22. 实时荧光定量PCR检测各GSPCs放射后CD133基因表达水平变化实时荧光定量PCR检测各GSPCs放射后CD133基因表达水平变化

  23. PCR芯片(96基因)检测U-87MGGSPCs 10Gy照射后72h DNA损伤信号通路基因变化

  24. 基因扩散图

  25. U-87MG GSPCs 放射前后DNA损伤通路相关基因变化3D图

  26. BRCA1是一肿瘤抑制基因，编码一核磷酸蛋白，其功能是维持基因组的稳定性，该基因下调使得细胞增殖、修复的抑制解除(-2.13) • GML编码蛋白能够抑制T细胞的活性，进而降低后者的肿瘤细胞杀伤活性(4.71) • IP6K3编码蛋白属于IPK家族，负责InsP6转变为InsP7，而InsP7增多有助于修复损伤的DNA双链(2.19) • N4BP2升高后编码的蛋白能够结合并水解ATP，并增强DNA损伤修复转录及基因修复能力(4.24)

  27. NBN编码蛋白属于MRE11/RAD50双链损伤修复蛋白家族的一员，它下调后可激活DNA损伤检查点及增强DNA损伤修复能力(-2.05)NBN编码蛋白属于MRE11/RAD50双链损伤修复蛋白家族的一员，它下调后可激活DNA损伤检查点及增强DNA损伤修复能力(-2.05) • PPP1R15A在细胞处于生长停滞及DNA损伤时其转录水平增高，而且PPP1R15A激活后可抑制P53的稳定性并使其活性下降，从而减少细胞凋亡(2.74) • RAD50编码的蛋白可与MRE11 及NBS1形成复合物，而这个复合物在肿瘤细胞照射后能够修复损伤的DNA双链、激活细胞周期关卡、保持端粒酶稳定性(2.42) • SEMA4A在照射后升高能够提升细胞的免疫及修复能力(3.46) • TREX1主要是编码3‘->5’DNA核酸外切酶，此酶对人DNA多聚酶有校正作用，照射后此基因上调，有助于校正损伤的DNA多聚酶，修复DNA双链(2.34) • XPA编码一锌指蛋白，而此锌指蛋白与DNA切除修复有关，故照射后XPA升高能提升DNA损伤双链修复能力(4.31)

  28. 结论 • CD133+胶质瘤干细胞在放射后显示出较强的耐受放射性及放射损伤修复能力，是耐受放射主体细胞 • CD133+细胞放射耐受的分子机制与放射后增强了肿瘤干细胞的双链损伤修复、DNA切除修复能力，及对人DNA多聚酶的校正，下调一些抑癌基因表达、以及将P53去功能化以减少凋亡等相关

  29. 欢迎指导交流！ 董军 13962157301 djdongjun@163.com 谢谢！

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