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基因工程专题

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基因工程专题 - PowerPoint PPT Presentation


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基因工程专题. 基因工程中涉及的现代生物学技术介绍 基因工程的操作过程 1 )工具酶的介绍 2 )载体的选择 3 )重组 DNA 的筛选. 1 、限制性核酸内切酶. 1 )来源及作用:. 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶 , 旨在将 DNA 片段 化。. 2 )特点:. 识别双链 DNA 分子上特定的核苷酸序列, ( 4-6 个碱基对,且具有 回文结构 )并有相应的酶切位点. 3 )结果:. 形成 黏性末端或平末端. 酶切产物片段数量计算:. 1 、线性 DNA 分子:. n+1. 如含 n 个酶切位点,则完全酶切后得 个 DNA 片段;.

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Presentation Transcript
slide2
基因工程中涉及的现代生物学技术介绍
  • 基因工程的操作过程

1)工具酶的介绍

2)载体的选择

3)重组DNA的筛选

slide3
1、限制性核酸内切酶

1)来源及作用:

主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶, 旨在将DNA片段化。

2)特点:

识别双链DNA分子上特定的核苷酸序列,

(4-6个碱基对,且具有回文结构)并有相应的酶切位点

3)结果:

形成黏性末端或平末端

slide4
酶切产物片段数量计算:

1、线性DNA分子:

n+1

如含n个酶切位点,则完全酶切后得个

DNA片段;

2、环状DNA分子:

n

如含n个酶切位点,则完全酶切后得个DNA片段;

slide5

黏性末端

黏性末端

5′

3′

3′

5′

slide6

GGATCC

CCTAGG

GTCGAC

CAGCTG

+

G

CCTAG

GATCC

G

GTC

CAG

GTC

CAG

GAC

CTG

GAC

CTG

HindⅡ

Bam HⅠ

+

+

黏性末端

平末端

2 dna
2、 DNA连接酶

1)作用部位:磷酸二酯键

2)结果:DNA重组

3)连接类型:具平末端的片段的连接

具黏性末端的片段连接

slide8

具平末端片段间的连接:

目的基因

载体

重组体

限制酶A

限制酶A

限制酶B

DNA连接酶

思考:

1、用限制酶A和限制酶B酶切重组体,可得几个DNA片段?

思考:

2、用DNA连接酶可得几种重组体?

slide9

GTCGAC

CAGCTG

CCCGGG

GGGCCC

GTCGGG

CAGCCC

+

+

GTC

CAG

CCC

GGG

GAC

CTG

GGG

CCC

HindⅡ:

SmaⅠ

slide10
具平末端的片段的连接
  • 特点:

1、特异性不强:

 无论限制酶是否相同,只要产生的都是平末  端,则可进行连接;

2、如用相同的限制酶酶切后,重组DNA分子上仍保留有原有限制酶的识别序列;如用不同的限制酶酶切后,重组DNA分子上原有限制酶的识别序列丢失,但可能产生新的限制酶的识别序列。

slide11
具黏性末端片段的连接:
  • 特点:特异性强

 用相同的限制性内切酶,可产生相同的黏性末端,方能进行DNA的连接。

slide12

GGATCC

CCTAGG

GATCC

G

G

CCTAG

GGATCT

CCTAGA

Bam HⅠ

Bg lⅡ

AGATCT

TCTAGA

A

TCTAG

+

+

GATCT

A

1、不同的限制酶如产生相同的黏性末端,    

  则可进行DNA连接。

2、重组DNA上的酶切位点可能改变。

slide13

1、08江苏生物32题:(5)

①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切,得到_________种DNA片断。

②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切,得到_________种DNA片断。

2

1

slide14
具黏性末端的片段间的连接

单酶切:

双酶切:

slide15
具黏性末端的片段间的连接
  • 单酶切:

用同种限制酶酶切DNA,可产生

相同的黏性末端。

slide16

载体

限制酶A

限制酶A

DNA连接酶

重组体

载体自

身环化

目的基因

目的基因

自身环化

slide17
具黏性末端的片段间的连接
  • 双酶切法:

用两种不同的限制酶酶切DNA,由于两端的黏性末端不一样,避免了DNA片段的自身环化。

优势:

形成的重组质粒只有一种,避免了筛选。

slide20
载体必须具备的条件
  • 能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。
  • 具有一个或多个限制酶切点,以便与外源基因连接。
  • 具有某些标记基因,便于进行筛选。
  • 必需是安全的,不会对受体细胞有害。
  • 大小应适合,便于提取和操作。
slide22

含一个抗性基因的质粒:

1、目的基因的插入位点:

抗性基因之外

2、导入的受体细胞是否应含抗

性基因: (如大肠杆菌)

不含

3、重组DNA的筛选:

slide23

导入大肠杆菌并接种

培养基含抗生素

第一次筛选:

出现菌落

无菌落

(质粒未导入)

出现菌落

第二次筛选:

含目的基因产物的检测

slide24

含两个抗性基因的质粒:

1、目的基因的插入位点:

插入一个抗性基因内,保留一个抗性基因

2、导入的受体细胞是否应含抗

性基因 (如大肠杆菌) :

不含

3、重组DNA的筛选:

培养基应怎样加入抗生素?

slide25

质粒导入大肠杆菌

无菌落

有菌落

无菌落

有菌落

有菌落

有菌落

slide26

两种培养基均无菌落

(质粒未导入)

导入大肠杆菌并接种

培养基含

抗生素1

培养基含

抗生素2

不出现菌落

出现菌落

出现菌落

出现菌落

大肠杆菌中含质粒

大肠杆菌中含质粒

大肠杆菌中含重组质粒

slide27
总结:
  • DNA连接

平末端、黏性末端连接

  • 单酶切和双酶切:

重组DNA(单酶切有三种,要筛选)

  • 根据质粒含有的抗性基因筛选

重组DNA是否成功导入