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基因工程专题

基因工程专题. 基因工程中涉及的现代生物学技术介绍 基因工程的操作过程 1 ）工具酶的介绍 2 ）载体的选择 3 ）重组 DNA 的筛选. 1 、限制性核酸内切酶. 1 ）来源及作用：. 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶 , 旨在将 DNA 片段 化。. 2 ）特点：. 识别双链 DNA 分子上特定的核苷酸序列， （ 4-6 个碱基对，且具有 回文结构 ）并有相应的酶切位点. 3 ）结果：. 形成 黏性末端或平末端. 酶切产物片段数量计算：. 1 、线性 DNA 分子：. n+1. 如含 n 个酶切位点，则完全酶切后得 个 DNA 片段；.

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Presentation Transcript

  1. 基因工程专题

  2. 基因工程中涉及的现代生物学技术介绍 • 基因工程的操作过程 1）工具酶的介绍 2）载体的选择 3）重组DNA的筛选

  3. 1、限制性核酸内切酶 1）来源及作用： 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶, 旨在将DNA片段化。 2）特点： 识别双链DNA分子上特定的核苷酸序列， （4-6个碱基对，且具有回文结构）并有相应的酶切位点 3）结果： 形成黏性末端或平末端

  4. 酶切产物片段数量计算： 1、线性DNA分子： n+1 如含n个酶切位点，则完全酶切后得个 DNA片段； 2、环状DNA分子： n 如含n个酶切位点，则完全酶切后得个DNA片段；

  5. 黏性末端 黏性末端 5′ 3′ 3′ 5′

  6. GGATCC CCTAGG GTCGAC CAGCTG + G CCTAG GATCC G GTC CAG GTC CAG GAC CTG GAC CTG HindⅡ Bam HⅠ + + 黏性末端 平末端

  7. 2、 DNA连接酶 1）作用部位：磷酸二酯键 2）结果：DNA重组 3）连接类型：具平末端的片段的连接 具黏性末端的片段连接

  8. 具平末端片段间的连接： 目的基因 载体 重组体 限制酶A 限制酶A 限制酶B DNA连接酶 思考： 1、用限制酶A和限制酶B酶切重组体，可得几个DNA片段？ 思考： 2、用DNA连接酶可得几种重组体？

  9. GTCGAC CAGCTG CCCGGG GGGCCC GTCGGG CAGCCC + + GTC CAG CCC GGG GAC CTG GGG CCC HindⅡ: SmaⅠ

  10. 具平末端的片段的连接 • 特点： 1、特异性不强： 　无论限制酶是否相同，只要产生的都是平末　　端，则可进行连接； 2、如用相同的限制酶酶切后，重组DNA分子上仍保留有原有限制酶的识别序列；如用不同的限制酶酶切后，重组DNA分子上原有限制酶的识别序列丢失，但可能产生新的限制酶的识别序列。

  11. 具黏性末端片段的连接： • 特点：特异性强 　用相同的限制性内切酶，可产生相同的黏性末端，方能进行DNA的连接。

  12. GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG GGATCT CCTAGA Bam HⅠ Bg lⅡ AGATCT TCTAGA A TCTAG + + GATCT A １、不同的限制酶如产生相同的黏性末端，　　　　 　　则可进行DNA连接。 ２、重组DNA上的酶切位点可能改变。

  13. 1、08江苏生物32题：（5） ①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 ②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________种DNA片断。 2 1

  14. 具黏性末端的片段间的连接 单酶切： 双酶切：

  15. 具黏性末端的片段间的连接 • 单酶切： 用同种限制酶酶切DNA，可产生 相同的黏性末端。

  16. 载体 限制酶A 限制酶A DNA连接酶 重组体 载体自 身环化 目的基因 目的基因 自身环化

  17. 具黏性末端的片段间的连接 • 双酶切法： 用两种不同的限制酶酶切DNA，由于两端的黏性末端不一样，避免了DNA片段的自身环化。 优势： 形成的重组质粒只有一种，避免了筛选。

  18. 5、（普陀）在构建含目的基因的重组质粒A时，如果使用EcoRⅠ进行酶切，则含目的基因的外源DNA 片段和质粒在DNA连接酶的作用下，至少可形成 种环状产物。 3

  19. 为防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用___________ (限制）酶进行切割。 BamHⅠ 和HindⅢ

  20. 载体必须具备的条件 • 能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 • 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 • 具有某些标记基因，便于进行筛选。 • 必需是安全的，不会对受体细胞有害。 • 大小应适合，便于提取和操作。

  21. 质粒的选择：

  22. 含一个抗性基因的质粒: 1、目的基因的插入位点： 抗性基因之外 2、导入的受体细胞是否应含抗 性基因： （如大肠杆菌） 不含 3、重组DNA的筛选：

  23. 导入大肠杆菌并接种 培养基含抗生素 第一次筛选: 出现菌落 无菌落 (质粒未导入) 出现菌落 第二次筛选: 含目的基因产物的检测

  24. 含两个抗性基因的质粒: 1、目的基因的插入位点： 插入一个抗性基因内,保留一个抗性基因 2、导入的受体细胞是否应含抗 性基因 （如大肠杆菌） ： 不含 3、重组DNA的筛选： 培养基应怎样加入抗生素?

  25. 质粒导入大肠杆菌 无菌落 有菌落 无菌落 有菌落 有菌落 有菌落

  26. 两种培养基均无菌落 (质粒未导入) 导入大肠杆菌并接种 培养基含 抗生素1 培养基含 抗生素2 不出现菌落 出现菌落 出现菌落 出现菌落 大肠杆菌中含质粒 大肠杆菌中含质粒 大肠杆菌中含重组质粒

  27. 总结： • DNA连接 平末端、黏性末端连接 • 单酶切和双酶切： 重组DNA（单酶切有三种，要筛选） • 根据质粒含有的抗性基因筛选 重组DNA是否成功导入

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