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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA.  INDUCCIÓN AL PROCESO DE CALLOGÉNESIS in vitro A PARTIR DE COTILEDONES Y EJES EMBRIOGÉNICOS DE SEMILLAS DE GUARANGO ( Caesalpinia spinosa ) COMO COADYUVANTE PARA SU PRESERVACIÓN EN EL DISTRITO METROPOLITANO DE QUITO.

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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

 INDUCCIÓN AL PROCESO DE CALLOGÉNESIS in vitro A PARTIR DE COTILEDONES Y EJES EMBRIOGÉNICOS DE SEMILLAS DE GUARANGO (Caesalpiniaspinosa) COMO COADYUVANTE PARA SU PRESERVACIÓN EN EL DISTRITO METROPOLITANO DE QUITO

Previo a la obtención del título de:

Ingeniera EN BIOTECNOLOGÍA

Elaborado por:

GABRIELA MARÍA ORTEGA ORDÓÑEZ

Director: Ing. Norman Soria

Codirector: Ing. Marco Taipe

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JUSTIFICACIÓN

PROBLEMA

Deforestación Mundial

La necesidad de grandes cantidades de ejemplares de especies nativas forestales - proyectos de Forestación y Reforestación MDMQ

El año 2001, DMQ existía aprox. 9.000ha de bosques naturales y plantaciones forestales.

CIAC => promueve biotecnologías agronómicas

Amortiguar impactos ambientales:

CALLOGENESIS en Caesalpiniaspinosa

Necesidad de 18.000ha de cubierta forestal

  • Especie nativa forestal
  • En peligro en extinción
  • Protección a suelos erosionados
  • Potencial industrial

Limitación de los viveros en la multiplicación de forestales

  • Prácticas tradicionales de cultivo
  • Obtención rápida y masiva de ejemplares
  • Mejoramiento de árboles forestales
  • Gran cantidad de mano de obra
  • Requerimiento de amplio espacio
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OBJETIVOS

General

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INTRODUCCIÓN

Guarango (Caesalpinia spinosa) (Molina) O. Kuntze

  • Descripción botánica

Distribución geográfica

  • 4 a 8 metros de altura
  • Árbol nativo de los Andes, 1500 a 3100 msnm
  • Ramas contienen espinas
  • Ecuador: Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Azuay y Loja
  • Hojas son compuestas, bipinadas, alternas en espiral
  • Frutos son legumbres aplanadas y curvas, que cambian de color, según su madurez de verde a rosado y finalmente rojo parduzco; de 5 a 10 cm de largo.
  • Mancha blanca (Oidium)
  • Enfermedades
  • Queresas y áfidos en hojas y en frutos
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INTRODUCCIÓN

  • Características de semillas de guarango
  • Capacidad germinativa que oscila entre 80 y 90%.
  • Germinación epigea, inicia entre los 8 a 12 días y finaliza a los 20 días.
  • Requiere un método de escarificación como tratamiento pre-germinativo.
  • Consta de un embrión
  • Eje embriogénico o embrionario
  • Endospermo
  • Cubierta seminal
  • Dicotiledónea

Excelente adaptabilidad

Protección y recuperación de suelos por proceso de erosión – Fijación N2

  • Propiedades del guarango

Potencial productivo de taninos

En asociación con cultivos mejora capacidad productiva

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INTRODUCCIÓN

Vías de generación masiva in vitro de plantas mediante inducción a callo

Tipos de explantes

Establecimiento in vitro

Planta madre

No viable

Proceso de Callogénesis

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MATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección química

Carboxin – Captan

Semillas maduras de plantas adultas de Caesalpiniaspinosa

Desinfección y establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Banco de semillas del vivero de Cununyacu de la EPMMOP-Q (-5°C)

Ensayo Preliminar de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Ensayo Final de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Identificación del callo embriogénico

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MATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones

LAVADO - DETERGENTE

40 min agitación

Solución 1:100 Detergente

Triple enjuague

Semillas en agua destilada por 2días

Escarificación con cautín en la zona del micrópilo

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MATERIALES Y MÉTODOS

Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Preparación medio MS

Siembra de los explantes

Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

Retirar la testa de la semillas y separar los cotiledones de los ejes

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MATERIALES Y MÉTODOS

Ensayo Preliminar de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Desinfección

Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

Siembra de los explantes

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MATERIALES Y MÉTODOS

Ensayo Final de Inducción a callo embriogénico a partir de Cotiledones

Desinfección

Extracción y Siembra de: cotiledones

Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Desinfección y Establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones

Explantes Vivos en Cotiledones y Ejes

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos.

Porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis COTILEDONES

Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte .

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis EJES EMBRIONARIOS

Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte .

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

FI

Formación de callo a partir de Cotiledones

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días.

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Tiempo de formación de callo a partir de Cotiledones

Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Morfología de callos formados a partir de Cotiledones

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en cotiledones.

Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los cotiledones, por combinación de conglomerados re-escalados.

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Cotiledones

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días.

Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Formación de callo a partir de Ejes embrionarios

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días.

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Tiempo de formación de callo a partir de Ejes

Porcentajes de callo formados en ejes embriogénicos a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo.

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Morfología de callos formados a partir de Ejes

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en ejes embriogénicos.

Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los ejes embriogénicos, por combinación de conglomerados re-escalados .

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Ensayo Preliminar de Inducción a Callo Embriogénico

Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Ejes E.

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días.

Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en ejes e., evaluados a los 60 días

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Formación de callo

Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones

PI

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación, ausencia de callo y callos descartados en cotiledones, evaluados a los 60 días.

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Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones

Tiempo de formación de callo

2,4D + Kin

TDZ + AIA

Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo

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Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones

Morfología de los callo

Según la textura y el color expresado en el callo formado se identifica el tipo de callo es decir si es embriogénico o no ya que depende del tratamiento.

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes del color y textura de los callo formados en cotiledones.

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Ensayo Final de Inducción a Callo Embriogénico en Cotiledones

Identificación de callos de tipo embriogénico a partir de Cotiledones

Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días.

Porcentajes de callos embriogénicos, no embriogénicos y ausencia de formación de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días

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RECOMENDACIONES

  • Para disminuir el porcentaje de necrosis en la desinfección de cotiledones y ejes embriogénicos se deberá probar nuevos procesos de desinfección basado en la utilización de peróxido de hidrógeno (H2O2) puesto que ha presentado buenos resultados en la desinfección de semillas de otras especies.
  • Es importante realizar otro tipo de estudios histológicos con la finalidad de identificar estructuras adicionales a las ya señaladas para tener un mayor conocimiento referente a los procesos de la callogénesis in vitro en cotiledones de Caesalpiniaspinosa que permita ampliar su entendimiento.
  • Continuar la investigación, tendiente a lograr un protocolo eficiente de embriogénesis somática indirecta en cotiledones y ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpiniaspinosa.
  • Con base en los resultados obtenidos, se podría probar nuevas combinaciones y concentraciones adicionales de auxinas y citoquininas para la obtención de callos embriogénicos en ejes embriogénicos.
  • Ya que se generaron posibles vías de organogénesis en los ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpiniaspinosa, se puede continuar el estudio ésta ruta in vitro de generación masiva de plantas.