Kromatografi

1. KROMOTOGRAFİ, ELEKTROFOREZ, SPEKTRAL YÖNTEMLER, RADYOİZOTOPLAR, İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER, NÜKLEİK ASİT HİBRİDİZASYONU, ELEKTRON MİKROSKOBİSİ

2. Kromatografi Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılan bir ayırma yöntemidir. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir. Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir.

3. Hareketli faz Durağan faz moleküller

4. Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. • • Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. • • Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. • • Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" olguları temel etkileşim türlerini oluştururlar. Şayet basit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir.

5. Bu durumda farklı polaritelere (kutuplaşmalara)sahip maddelerin, farklı derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır. Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

6. Şayet sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur. Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön plana geçmektedir.

7. Buna bağlı olarak hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "dağılım kromatografisi" genel adı ile anılırlar.

8. Çeşitli kromatografik yöntemler vardır. Bunlardan bazıları; Kolon kromatografisi, İnce tabaka kromatografisi (ITK), Kağıt kromatografisi, Gaz kromatografisi, İyon değişimi kromatografisi, Jel geçirgenlik kromatografisi, Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, İlgi kromatografisidir.

9. Bunlardan en çok kullanılanları sıralayacak olursak; • Kolon kromatografisi • İnce tabaka kromatografisi (ITK) • Kâğıt kromatografisi • Gaz kromatografisi

10. 1.KOLON KROMATOGRAFİSİ depo (tampon) mobil faz (tampon) Protein karışımı sabit faz (katı porlu matriks) elüent •Kolon kromatografisi:biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır •Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur  SABİT FAZ •biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir •Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler  önce adsorbe edilenler  daha geç kolondan çıkarlar

11. Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: • Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür(kansorojen), n-Butanol İzopropanol olabilir.

13. Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: •Jel filtrasyonu  büyüklük •İyon exchange  yük •Affinite  (bağlanma)

14. Jel Filtrasyon Kromatografi •Kolon, jel boncuklar [polisakkarid veya poliakrilamid polimer] ile doldurulur katı matriks •Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir Küçük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar akış cam kolon jel boncuklar Büyük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara takılmaz, kolondan önce çıkarlar Biyomoleküllerin, molekül büyüklüğüne göre ayrılırlar

15. Jel Filtrasyon Kromatografi Proteinlerin elüsyonu: en büyük en küçük

16. Jel Filtrasyon Kromatografi jel boncuk en büyük protein Biyomeleküllerin, matriksteki porlara takılma yüzdesi, büyüklüğü ile ters orantılıdır Porlara takılan moleküller daha yavaş sürüklenirler • Avantaj: Büyük miktardabiyomolekül karışımı saflaştırılabilir • Dezavantaj: Yavaş ayırım

17. İyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi •Biyomolekül karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla[ (+)(+) veya (-) (-) ile] yer değiştirerek, kolona bağlanırlar •Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar • Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı moleküllerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır Proteinleri, üzerlerinde taşıdıkları net yüke göre ayırır.

18. İyon-Exchange Kromatografi

19. Affinite Kromatografisi Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır: Tampon akışı ligand-protein kompleksi Ligand bağlı boncuk spesifik protein Serbest proteinler diğer proteinler

20. spesifik protein katı destek ligand selüloz sepharoz dekstran DNA IgG histon protein A AffiniteKromatografisi + • antibodyantijen • antijen antibody • substrat enzim • kosubstrat enzim • Konkavalin A glikoprotein • reseptor hormon

21. glukoz-protein kompleksi İlave glukoz(G) boncuk serbest protein boncuk AffiniteKromatografisi Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir Örnek:

22. 2. İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ (İTK) İnce tabaka kromatografisi, bir "katı -sıvı adsorpsiyon kromatografisidir." Bu yöntemde sabit faz, çeşitli boyutlardaki "cam plakalar üstüne, ince bir tabaka halinde sıvanmış katı adsorban maddedir. "Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina, siliko jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür.

23. Bu işlem sırasında, plakanın alt kesimlerine bir damlalıkla önceden damlatılmış olan karışımı da farklı hızlarla yukarıya sürükler. Ayırım bu şekilde sağlanmış olur. Yürüme hızı maddenin, katı fazın ve çözücünün polaritesine bağlıdır.

25. 3.KâğıtKromatografisi Bu yöntemde kalın bir süzgeç kağıdı destek; ve gözeneklerine yerleşen su ise, sabit "sıvı fazı" oluşturur. Hareketli faz bir yürütücü tank içine yerleştirilmiş uygun bir sıvıdır. Bu durumda, kâğıt kromatografisinin bir "sıvı-sıvı dağılım kromatografisi" olduğunu belirtmeliyiz.

29. 4. Gaz Kromatografisi Bu teknik laboratuarda basit aletlerle yürütülemez. Yöntemin uygulanmasında çok gelişmiş otomatik cihazlar gereklidir.

30. Bu yöntemde sabit faz, cihaz içine yerleştirilen ve içinde katı destek maddesi üzerinde emdirilmiş sıvı bulunan bir kolondur. Taşıyıcı faz ise, He veya N2 gibi bir gazdır. Buna göre gaz kromatografinin bir "gaz-sıvı dağılım kromatografisi" olduğunu belirtebiliriz.

31. Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla gaz kromatografisi yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir. Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulmasi ile 0.2-0.5 mm iç çapinda ve 10-50 m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliligi ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir. Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmus uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir.

32. Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir.Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu sebeple de,bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur. Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.Örneğin, enjekte ettigimiz bir karışımda baslangıçta eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda bu bilesenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit olacaktır.

33. Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi uygulanır. Baslangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.

34. ELEKTROFOREZ Sulu bir çözelti içinde, suspansiye ya da çözünmüş küçük elektrik yüklü parçacıkların, uygulanan bir elektrik alanın etkisi ile göçetmesi sürecine, elektroforez denir. Bu küçük parçacıklar bakteri hücreleri, virüsler, protein molekülleri veya sentetik parçacıklar olabilir. Doğal olarak bu parçacıkların çoğu elektrik yükü taşırlar

35. ELEKTROFOREZ Ortam pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak yüklenen taneciklerin, bir elektrik alanında, kendi net yüklerine zıt yük taşıyan anot veya katoda doğru farklı hızlarda sürüklenmeleridir. Elektroforez, genellikle poliakrilamid jel üzerinde yapılır.

36. POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (PAGE) En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. Jel sentetik bir madde olan akrilamid ile akrilamid türevi olan N-N'-metilen bisakrilamidin polimerleşmesiyle oluşturulur ve örnekler bu jel içinde yürütülür. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir.

37. Poliakrilamid Jel Elektroforezi(PAGE) protein karışımı katot plastik kasa tampon anot jel tampon

38. Gel electrophoresis is a technique for separating charged molecules with different sizes.  Two kinds of gels are commonly used: agarose and polyacrylamide.  Agarose gels can be applied to a wider range of sizes than polyacrylamide gels.  By using standard agarose electrophoresis, nuclei acids up to 50 kb may be separated.  If Pulsed Field Gel Electrophoresis is used, the upper limit can be extended to 10 Mb.  Polyacrylamide gels may separate nucleic acids that differ in length by only 1 nucleotide if their length is less than 500 bp

39. SDS PAGE ( denatüre edici page) SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri biribirinden ayırır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda '(-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır.

40. SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması amacıyla kullanılmaktadır.

41. SDS - PAGE SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre, birbirinden ayrılırlar SDS’in bağlanmasıyla , doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar  elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekül ağırlıklarına bağlıdır Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir ve proteinlerin alt üniteleri birbirinden ayrılır

42. SDS-PAGE ÖRNEKLERİ

43. nümune Standart Molekül ağ.(log) nümune protein Sürüklenme hızı Molekül Ağırlığı Tayini

44. AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ Agaroz, deniz yosunlarından elde edilen, dallanmamış zincirli bir polimerdir. Moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılabilme özellikleri, jel elektroforezinin pek çok amaç için kullanımına olanak sağlamıştır. Nükleik asit fragmentlerinin tanımlanması, saflaştırılması ve ayrılması için kullanılan en yaygın yöntem agaroz jel elektroforezidir.

45. Bu nedenle çeşitli amaçlar için izole edilen DNA ve RNA'ların tanımlanabilmesi, temizliğinin kontrolü, hangi formda olduğunun belirlenebilmesi, büyüklüğünün saptanabilmesi ve özellikle genetik mühendisliği teknikleri ile DNA yapısında oluşturulan değişikliklerden sonra elde edilen yeni formların incelenmesi yönünden, agaroz jel elektroforez tekniği, moleküler genetik alanında önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır.

47. SPEKTROFOTOMETRE Optik tekniğe dayalı olarak çalışan aletlerden moleküler biyolojide en fazla kullanılanı spektrofotometredir. Bu alet seçilmiş dalga boylarında ışık oluşturur, ışığı (bir küvet içine konulmuş ve genellikle bir çözücü içersinde bulunan) örneğin içersinden geçirir ve örnekten geçen ışığın şiddetini ölçer.

48. Her bir ışın dalgalar halinde yayılan ve belli enerjiye sahip fotondur. İki dalganın en yüksek noktaları arasındaki mesafe dalga boyu olarak adlandırılır. Dalga boyu uzunluk birimleri cinsinden ifade edilir. Genel olarak Angstrom tabiri kullanılmakla birlikte spektrofotometrik ölçümlerde daha çok nanometre, mikrometre, veya milimikron tabirleri kullanılır. 10AO=1 nM=1 milimikron.

49. UV ışık bölgesindeki ölçümler için 200-340 nm dalgaboyları arasında radyasyon oluşturan yüksek basınçlı hidrojen veya dötaryum lambası, görünür ışık bölgesi için 340-800 nm dalgaboyları arasında ışık veren tungsten halojen lamba kullanılır. Bu lambaların standart bir ışık çıktısı vermesi gerekir.

50. Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre adlandırılır. Dalga boylarına göre; 200-340 nm : Ultraviyole 340-800 nm : Görünür 800-2000 nm: İnfrared