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第十一章 动物基因工程. 基因工程的概念： 利用 DNA 体外重组或 PCR 扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组 DNA 分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程. 基因工程 (gene engineering) 常和以下名称混用. 遗传工程 (genetic engineering); 基因克隆 (gene cloning); 分子克隆 (molecular cloning); 基因操作 (gene manipulation);
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第十一章 动物基因工程 • 基因工程的概念： • 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用 • 遗传工程(genetic engineering); • 基因克隆(gene cloning); • 分子克隆(molecular cloning); • 基因操作(gene manipulation); • 重组DNA技术(recombination DNA technique) • 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系. • 作动词时是指基因的分离与重组过程。
第一节 基因工程的发展历程 • 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 • 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 • 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 • 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼
1993基因工程西红柿在美国上市 • 1997英国罗斯林研究所 多莉羊
簡介 耐农药/抗虫能力(第一代) Bt抗虫玉米 传统玉米 Source: Monsanto (Input Traits) 4
改变营养组成(第二代) 黃金米可以防治维生素A缺乏症成为健康食品 (Output Traits) 5
好好吃的樣子 生产医药及工业用(第三代) 我也想吃! (Output Traits) [複製人! 和我有什麼關係] 陳文君著 泛亞 2001 6
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。 胰岛素分子结构
将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%! 胰岛素生产车间
1982年: “超级鼠” 带有人生长激素基因的 转基因小鼠 正常小鼠
干扰素分子结构 干扰素生产车间 • 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。
基因工程人干扰素α-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。
人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。 人造血液及其生产
转基因鱼 • 生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)
转基因牛 • 乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)
Fourteen month-old genetically engineered (“biotech”) salmon (left) and non-engineer salmon (right).
世界上第一個…. 基因改造蕃茄 1994年美國加州 FlavrSavr Tomato, Calgene Photo by Jack Dykinga. Sources ARS Photo Unit, 2001, USDA. 3
Sometimes Biotechnology Involves the Manipulation of Natural Biological Processes Without Modifying Genes Dolly and surrogate Mom Dolly (left) was a clone created without the need for any genetic modifications.
(Science (2002) 295:1443) Copy Cat – the First Cloned Pet
基因工程试剂的高回报 • 碱性成纤维细胞生长因子 231元/ug • 红细胞生成素 1072元/ug • 白细胞介素-2 410元/ug • 巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ug • 胰岛素 10.2元/mg
二、基因工程的基本程序 • 一.分—载体和目的基因的分离 • 二.切—限制性内切酶的应用 • 三.接—载体与目的基因连接成重组体 • 四.转—基因序列转入细胞 • 五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定
一.分—载体和目的基因的分离 • （一）载体 • 1.质粒（plasmid) • 2.噬菌体（phage) • 3.动物病毒载体（virus)
质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
（二）.目的基因的来源和分离 • 1.PCR • 2.基因组文库 • 3. cDNA文库 • 4.人工化学合成
1.限制性内切酶概念 简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特定碱基序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 限制酶从原核生物中提取，现已发现了600多种。 二.切—限制性内切酶的应用
2.命名 例：Eco R I，这是从大肠杆菌（Ecoli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶 Eco R I 属名 种名 株名 序号
3.作用 • 限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是对DNA分子进行操作的手术刀。
Ⅱ型限制性内切酶的基本特征 • ⑴在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使DNA双链断裂； • ⑵识别序列一般为4~7个碱基对，这些碱基顺序大都是沿中心轴回转180°可以重合，也称回文序列。 • ⑶能产生两种切割方式： • 错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端
三.接—载体与目的基因连接成重组体 • 1.粘性末端连接 • 2.平端连接
常用的DNA限制性内切酶的专一性 酶 辨认的序列和切口 说明 Alu I ‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥ 四核苷酸，平端切口 Bam H I 六核苷酸，粘端切口 ‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Bgl I ‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥ Eco R I 六核苷酸，粘端切口 ‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥ Hind Ⅲ 六核苷酸，粘端切口 ‥ ‥A A G C T T‥‥ ‥ ‥T T C G A A ‥‥ 六核苷酸，粘端切口 Sal I ‥ ‥G T C G A C ‥‥ ‥ ‥C A G C T G ‥‥ Sma I 六核苷酸，平端切口 ‥ ‥C C C G G G ‥‥ ‥ ‥G G G C C C ‥‥
四.转—基因序列转入细胞 • 1.转化 • 以质粒作为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程 • 2.转染 • 以噬菌体或或病毒为载体构建的重组DNA分子引入受体细胞的过程
五.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 • 1.按重组载体的标志进行筛选 • 2.核酸杂交法 • 3.DNA限制性内切酶图谱分析 • 4.PCR • 5.免疫学方法
