NK buňky Interferony

1. NK buňkyInterferony

2. NK buňky • Součást antigenně nespecifických mechanismů • Nemají antigenně specifické receptory • Rozeznávají bb., které mají abnormálně málo MHCgpI (některé nádorové a virem infikované bb.) • Jsou schopny zabíjet rychle – bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace • Aktivátory NK bb. – IFNa, IFNb

3. Stimulační receptory NK bb. - některé povrchové lektiny, Fc receptor CD16 • ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) cytotoxická reakce závislá na protilátkách; NK b. prostřednictvím Fc receptorů CD16 rozpozná buňku opsonizovanou protilátkami třídy IgG, to vede k aktivaci cytotoxických mechanismů (degranulaci NK bb.) • Inhibiční receptory NK bb. – signály poskytnuté prostřednictvím těchto receptorů inhibují cytotoxické mechanismy • Imunoglobulinová skupina – tzv. KIR (killer inhibitor receptors) • C-lektinová skupina – např. CD94/NKG2

4. Cytotoxické mechanismy NK buněk • Výsledná reakce NK b. po setkání s jinou buňkou závisí na tom, zda převáží stimulační nebo inhibiční signály • Cytotoxická granula obsahující perforin a granzymy (perforin vytváří póry v cytoplazmatické membráně napadené buňky,v některých případech může dojít k osmotické lýze napadené buňky, vytvořenými póry se do buňky dostávají granzymy, které aktivují caspázy, což vede k apoptóze napadené buňky • Fas-ligand (FasL) – který se váže na apoptotický receptor Fas (CD95) přítomný na povrchu mnoha různých bb. • TNFa

7. Interferony • Patří k humorální složce nespecifických mechanismů • IFNa - produkován virem napadenými lymfocyty, monocyty a makrofágy • IFNb - produkován virem infikovanými fibroblasty a epiteliemi • IFNa aIFNb – váží se na receptory na povrchu infikovaných a zdravých bb. a navozují v nich antivirový stav (syntéza enzymů, které blokují replikaci viru v buňce) • IFNg – produkován TH1 buňkami, má regulační funkci, aktivuje makrofágy a stimuluje expresi MHCgp

8. Bazofily a mastocyty a jejich význam v imunitních reakcích

9. Mastocyty ( žírné buňky) • Slizniční mastocyty – ve sliznicích dýchacího a gasrtointestinálního traktu, produkují histamin, serotonin, heparin, tryptázu,leukotrien C4…, účastní se při parazitózách a při alergiích • Pojivové mastocyty – v pojivové tkáni, produkují tryptázu, chymázu, PGD2…, jsou zmnoženy při fibróze, při parazitózách a alergiích se neúčastní

10. Funkce mastocytů • obrana proti parazitárním infekcím • za patologických okolností jsou zodpovědné za časný typ přecitlivělosti (imunopatologická reakce typu I) • regulace imunitní odpovědi • uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při remodelaci tkání • podílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznic • přispívají k normálnímu metabolismu pojivových tkání • komunikace mezi imunitním a nervovým systémem

11. Schema aktivace mastocytu • Žírné buňky mohou být stimulovány k degranulaci prostřednictvím přímého poškození (opiáty, alkohol, a některá antibiotika), propojením Fc receptorů pro IgE, nebo anafylatoxiny (C3a, C5a) • Po navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného parazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI) dojde k agregaci několika molekul FcRI • Iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu) • Aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2) • Zahájení produkce cytokinů (TNF, TGF, IL-4,5,6…) • Receptor pro komplementový fragment C5a (aktivace degranulace nezávislé na IgE)

13. Sekreční produkty mastocytů • cytoplazmatická granula: hydrolytické enzymy, proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát), biogenní aminy (histamin,serotonin) • Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu a GITu (napomáhá eliminaci parazita) • Metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2) • Cytokiny (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

14. Úloha mastocytů při rozvoji alergické reakce

15. Bazofily • diferencují se z myeloidního prekurzoru • bývají považovány za cirkulující formu mastocytů • receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi podobné mastocytům • jsou zodpovědné za vznik anafylaktického šoku

16. HLA systém(MHC glykoproteiny)

17. MHC glykoproteiny I. třídy (major histocompatibility complex) • Funkcí MHC gpI je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou (včetně virových, pokud jsou přítomny), na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými CD8) • Přítomny na všech jaderných buňkách organismu • 3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C ) • 3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)

18. Struktura MHC gp I • MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce aa nekovalentně asociovaného b2mikrotubulinu • Řetězec a má 3 domény, 2 N-terminální (a1, a2 – vazebné místo pro peptidy) a 1 C-terminální doménu (a3 – zakotvena v cytoplazmatické membráně, struktura podobná imunoglobulinové doméně) • Vazebné místo pro peptid je strukturně význačná rýha, jejíž dno je tvořeno b strukturou a boky jsou ohraničeny 2 a šroubovicemi • Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

19. Vazba peptidů na MHC gp I • MHC gp I váží peptidy o délce 8 až 10 AK • Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv (rozhodující jsou AK poblíž konců peptidu) • K vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém retikulu během biosyntézy MHC gp. • Po vytvoření řetězce a a b2mikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchu • Navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump

20. Neklasické MHC gp. I • HLA – E, -F, -G; molekuly CD1 • Strukturně podobné klasickým MHC gp • Jsou méně polymorfní • Vyskytují se jen na některých buňkách • Specializují se na vazbu zvláštních ligandů

21. HLA-E a HLA-G - vyskytují se na buňkách trofoblastu • Komplexy HLA-E a HLA-G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v děloze • Molekuly CD1 - váží glykolipidy či jiné silně hydrofobní látky, tyto komplexy jsou rozpoznávány specializovanými ab T lymfocyty (NK-T lymfocyty)

22. MHC glykoproteiny II. třídy • Funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými CD4) • Vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) • 3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

23. Struktura MHC gp II • MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových podjednotek a a b • Vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami a1 a b1 • Vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

24. Vazba peptidů na MHC gp II • MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK (ale i delší - vazebné místo pro peptid je na obou koncích otevřené) • Určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv • Po vytvoření řetězce a a b v ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního řetězce, který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s endozómy, poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchu

26. Polymorfismus MHC glykoproteinů • HLA komplex se nachází na chromozómu 6 • U MHC gp je vysoký polymorfismus, tzn. existují až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce a) • Kodominantní dědičnost alelických forem(jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách) • Polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince i na úrovni populace • Polymorfismus MHC gp způsobuje komplikace při transplantacích

27. HLA typizace= určení HLA antigenů na povrchu lymfocytůProvádí se při předtransplantačním vyšetření a při určení paternity 1) Sérologická typizace • mikrolymfocytotoxický test • allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky)) • princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) • za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. • (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

28. 2) Molekulárně genetické metody • Pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů 2a) PCR-SSP • = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery • extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí • každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro určitou alelu (resp. skupinu alel) • pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou • každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický obraz

29. 2b) PCR-SSO • = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy • namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA • hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé alely 2c) PCR- SBT • = sequencing based typing; sekvenování • nejpřesnější metodika HLA typizace • získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel

30. Imunoglobuliny

31. Struktura imunoglobulinů • 2 těžké (H) řetězce kovalentně spojeny cystinovými můstky, ke každému H řetězci je cystinovým můstkem připojen lehký (L) řetězec • H řetězec se skládá ze 4 až 5 domén (1 variabilní, 3-4 konstantní) • L řetězec se skládá ze 2 imunoglobulínových domén (1 variabilní, 1 konstantní) • Typy L řetězců - k,l • Typy H řetězců – m, d, g (g1-4), a (a1,a2), e

32. Variabilní domény L a H řetězce tvoří vazebné místo pro Ag • Pantová oblast = místo, kde jsou těžké řetězce spojeny cystinovými můstky • Fc části imunoglobulínů jsou silně glykosilovány, váží se na Fc receptory • J řetězec • Sekreční komponenta

34. Protilátka štěpená papainem Protilátka štěpená pepsinem

35. Funkce imunoglobulinů • Neutralizace Ag • Aglutinace Ag • Aktivace komplementu • Opsonizace (IgM, IgG, IgE) • Aktivace mastocytů prostřednictvím IgE • ADCC

36. Třídy imunoglobulínů a jejich funkce • Rozlišujeme podle konstantní části H řetězce • IgM, IgD, IgG ( IgG1 – IgG4), IgA (IgA1, IgA2), IgE • IgM - jako monomer tvoří BCR - sekretovaný ve formě pentamerů (10 vazebných míst) - první izotyp, který se tvoří po setkání s Ag - neutralizace Ag, aktivuje komplement, neváže se na Fc receptory fagocytů - (koncentrace 0,9 – 2,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) • IgD - jako monomer tvoří BCR - v séru se nachází ve velmi malé koncentraci - (koncentrace 0,1 g/l; biol. poločas 3 dny)

37. IgG - jednotlivé izotypy IgG1-IgG4 se liší schopností aktivovat komplement a vázat se na Fc receptory fagocytů (opsonizace) - funkce: neutralizace, opsonizace, aktivace komplementu - přestupuje placentou - tvořen při sekundární imunitní odpovědi - (koncentrace 8 – 18 g/l; biol. poločas 21 dnů)

38. IgA - slizniční IgA -ochrana sliznic, neutralizace, opsonizace, neaktivuje komplement - dimér se sekreční komponentou - sliny, slzy, mateřské mléko - sérový IgA – monomer, dimer či trimer - (koncentrace 0,9 – 3,5 g/l; biol. poločas 6 dnů) • IgE- uplatňuje se při obraně proti mnohobuněčným parazitům - je hlavní příčinou alergických reakcí - (koncentrace 3x10-4 g/l; biol. poločas 2 dny)

40. Genetický základ tvorby imunoglobulinů

41. Genové segmenty pro H řetězce - chromozóm 14 • V (variabilita) - několik set • D (diversita) - asi 50 • J (joining) – 9 • C konstantní části H řetězce • Genové segmenty pro L řetězce - k chromozóm 2 - l chromozóm 22 • V (variabilita) • J (joining) • C konstantní části L řetězce • Na koncích V, D, J úsekůjsou signální sekvence, které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázami, které provádějí přeskupování těchto genů • Po stranách C segmentů jsou tzv. switch sekvence (přesmykové), které jsou rozpoznávány enzymy rekombinázami, které provádějí izotypový přesmyk

42. Přeskupování genů kódujících H řetězce • D-J přeskupení - vyštěpení úseku IgH mezi některým D a J segmentem (probíhá na obou chromozómech) • V-D přeskupení – vyštěpení úseku mezi některým V segmentem a DJ; pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. alelická exkluze( to platí i pro L řetězce) Přepis přeskupeného IgH genu do mRNA, sestřih primárního transkriptu. Jako první se tvoří H řetězce m. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

43. Přeskupování genů kódujících L řetězce • Nejprve se přeskupují geny kódující L řetězec k,dochází k vyštěpování úseků mezi některým V a J segmentem (souběžně na obou chromozómech), pokud je přeskupení na některém z chromozómů úspěšné, zastaví se přeskupování na druhém chromozómu – tzv. alelická exkluze. • Jestliže není přeskupování k genů úspěšné, zahájí se přeskupování genů l. • Ne všechny H a L řetězce mohou spolu tvořit stabilní dimery. Není-li přeskupování úspěšné, B lymfocyt hyne.

44. Variabilita imunoglobulinů Variabilita imunoglobulinů je dána: • Různorodostíkombinací V(D)J segmentů • Spojovací variabilitou – po vyštěpení genových úseků nejsou konce odstřiženy zcela přesně • Enzymterminální transferáza – prodlužuje odstřižené konce o krátké náhodné tzv. N-sekvence • Somatické mutace V segmentů přeskupených genů po kontaktu s Ag na povrchu FDC

45. Izotypový přesmyk (class switch) • Dochází k němu během terminální diferenciace B lymfocytu po aktivaci Ag na povrchu FDC (nezbytný kostimulační signál přes CD40) • Enzymy rekombinázy rozpoznávají switch sekvence lokalizované po stranách C segmentů (tato sekvence není mezi Cm a Cd segmenty – B buňka může před izotypovým přesmykem produkovat IgM i IgD zároveň)a vyštěpují úseky genů • Po eliminaci části C oblasti je do mRNA přepsán ten segment, který je nejblíže VDJ segmentu a po sestřihu a translaci vzniká příslušný izotyp H řetězce

47. Izotypový přesmyk (class switch) - pokračování • Cytokiny regulují k jakému izotypovému přesmyku dojde: • IL-4 stimuluje přesmyk na IgE a IgG1, IgG4 • TGFb stimuluje přesmyk na IgG2 a IgA • Regulace, zda půjde o sekretovanou či membránovou formu probíhá na úrovni mRNA (na 3´konci C segmentu jsou za sekvencemi kódujícími secernovanou formu sekvence pro membránovou formu)

48. Antiidiotypové protilátky • IDIOTOP = každá determinanta variabilní části protilátky, může být součástí paratopu, či může ležet mimo paratop • IDIOTYP = soubor idiotopů; souhrn identických vazebných struktur pro Ag na protilátkách stejné specifity • Idiotypické struktury protilátek 1. generace jsou rozpoznávány některými B lymfocyty jako antigeny a mohou se proti nim tvořit tzv. antiidiotypové protilátky (protilátky 2. generace; některá vazebná místa mohou připomínat Ag, který vyvolal tvorbu protilátek 1. generace) • Proti protilátkám 2. generace se tvoří protilátky 3. generace (anti-antiidiotypové protilátky) • Tato idiotypová síť může hrát roli v regulaci protilátkové odpovědi

49. B lymfocyty

50. B lymfocyty • B-lymfocyty (B buňky) jsou buňky zodpovědné především za specifickou, protilátkami zprostředkovanou imunitní odpověď. Mají rovněž velký význam pro imunitní paměť (využívá se při očkování). • B-lymfocyty rozpoznávají nativní antigen pomocí BCR (B cell receptor) • Příslušný B-lymfocyt, na jehož receptorech došlo k vazbě antigenu, je stimulován k pomnožení a diferenciaci na efektorové neboli plazmatické bb., které produkují velké množství protilátek stejné specifity, jako je BCR (jde vlastně o tentýž protein v rozpustné formě), vážou se tedy na stejný antigen. Z části stimulovaných B-lymfocytů se diferencují paměťové buňky.