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实验十 大肠杆菌( E.coil )梯度转移基因定位(非中断杂交) (一). 一、目的 : 熟悉细菌接合和基因定位分析的原理; 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术; 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。. 二、内容 : 母液配制,培养基培制,器具干热、湿热灭菌。 活化菌种,接种,扩菌,杂交,涂平板,培养,点种 A ,点种 B-G 。 实验结果观察统计分析,基因位点距离计算。. 配对区. 致育基因区. 大肠杆菌菌株: 1 ) F - 菌株 2 ) F + 菌株
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实验十 大肠杆菌(E.coil)梯度转移基因定位(非中断杂交)实验十 大肠杆菌(E.coil)梯度转移基因定位(非中断杂交) (一) 一、目的: 熟悉细菌接合和基因定位分析的原理; 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术; 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。
二、内容: 母液配制,培养基培制,器具干热、湿热灭菌。 活化菌种,接种,扩菌,杂交,涂平板,培养,点种A,点种B-G。 实验结果观察统计分析,基因位点距离计算。
配对区 致育基因区 大肠杆菌菌株: 1)F - 菌株 2) F + 菌株 3)高频重组菌株(Hfr) 复制区 “雌性” 原点 “雄性” 二、实验原理: F因子: DNA小环,占染色体DNA的2% 。
Hfr菌株×F-菌株: Hfr染色体从原点断裂,染色体向Fˉ菌株起始转移。 杂交时间: 全部染色体进入Fˉ需要100min。
杂交: F-菌株 × Hfr菌株 F-菌株 × F+菌株 F+菌株 F-不同类型的重组子菌株
随机中断:各种条件影响→转移随机中断。 完整染色体进入Fˉ细菌的机会很少,完整的F因子转移机会也很低。导致: 1)Hfr菌株与F-菌株的杂交一般不会使Fˉ变成Hfr 或F+。 2)Hfr染色体上的基因呈梯度转移: a b a c b a d c b a
杂交基因定位 非中断杂交(interrupted matting)基因定位: 自然中断 重组的百分率为指标 中断杂交(non-interrupted matting)基因定位: 人为中断接合 供体基因在受体中的出现时间为指标 后者比前者操作复杂 两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差(以传 统重组作图更好)。
三、实验材料: Hfr品系:CSH60 Strs,其余性状为野生型(供体) F-品系:CSH57 Strr,多重生化缺陷型: (met、lue、 trp、his、ade or pur、arg、lac、gal) (受体) 杂交 Fˉ接受Hfr不同长度染色体→重组→各种重组子
F-品系(受体) : CSH57 Strr ,多重生化缺陷型 不能合成 met、lue、 trp、his、ade or pur、arg 不能利用 lac、gal
如何选出各种重组子,排除供(父)、受(本)体?如何选出各种重组子,排除供(父)、受(本)体? 选择性标记(selected marker)基因: 目的:选择出全部的重组子,排除杂交中的受体菌。 选什么样的基因? 措施:培养基中不加Met和Leu。 Met和离Leu离原点最近 反选择性标记(nonselected marker)基因: 目的:排除供体菌,同时保证全部的重组子存活。 选什么样的基因? 措施:在培养基中添加链霉素(Str)。 Str离原点最远,使Hfr染色体更多机会进入受体
本实验所配制的选择培养基: A培养基: 排除供、受体 选择全部重组子 B~G培养基: 选择各种重组子 求出重组频率 确定基因连锁情况
各种选择性培养基 A BC D E F G ←---- 葡萄糖 --------------→ 乳糖半乳糖 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 添加物质 碳源 10×A 琼脂粉 水 MgSO4 硫胺素(盐酸噻胺,VB1) 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 组氨酸 链霉素
四、方法步骤: 重组子数目取决于接合细胞数,通常Hfr与Fˉ细胞数之比为1:10~20 。 重组子的检出:影印法,单菌落点种法 本次实验——单菌落点种法。
点B-G板 涂A板 点A板 供体CSH60 接合 37 °C 24~48h 扩菌 B 37 °C 振荡100‘ 37 °C 24~48h 37 °C 24~ 48h A 1环菌 A对照 37 °C 2~3h 接种 C 0.1ml A 1ml 点50个单菌落 3个200μL LB LB A D 0.2 ml 37°C 10~12h 观察结果 A 1ml 4 ml 3个100μL E LB A LB 点50个单菌落 0.1ml 1环菌 A F A对照 G 受体CSH57
第一部分工作:为杂交做准备——配制各类母液、培养基,包装,灭菌第一部分工作:为杂交做准备——配制各类母液、培养基,包装,灭菌 配制 各种选择性培养基的基本溶液 LB液体培养基 各种选择性培养基的配制 包装 各种器皿、用具
(一)配制各种选择性培养基的基本溶液 试剂名称 10 ×A 葡萄糖 乳糖 半乳糖 MgSO4.7H2O 硫胺素 精氨酸 色氨酸 组氨酸 腺嘌呤 配制量 500ml 200ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 25ml 溶液规格 (119页) 20% 20% 20% 0.25M 1mg/1ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 10mg/ml 注:1)色氨酸(Trp)需在50-60℃水浴条件下溶解。 2)腺嘌呤(Ade)不溶于水,需先用1N(不要过浓过稀)HCl调成糊,逐滴加1NHCl直到溶,再补水定容。 3)链霉素(Str)受热易分解,所以不能加入培养基中一起灭菌,而应在倒平板前,用无菌水现配现用。
(二)配制LB液体培养基: 150ml ,分装:2瓶/组,5ml / 瓶, 其余交给老师 (三)每组包装灭菌: 培养皿20个 蓝、黄tip头各1盒, 接合用的空三角瓶(100ml)1个 牙签200支(20支左右一包) 用50ml小三角瓶分装 更正:教材p118“LB液”配制中,蒸馏水应为1000mL
(五)配制各种选择性培养基(此为100mL培养基配方)(五)配制各种选择性培养基(此为100mL培养基配方) (每组需250ml) (每组各需30ml) A BC D E F G ←---- 葡萄糖 --------------→ 乳糖半乳糖 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 添加物质 碳源 10×A 琼脂粉 水 MgSO4 硫胺素 精氨酸 腺嘌呤 色氨酸 组氨酸 链霉素 2ml 10ml 2g 88ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml
配制方法: 1. 称取琼脂+水, 煮沸 2. 另取其它各成分于一小烧杯中,一同加入煮好的琼脂中。 3. 分装, 灭菌(8磅,112℃,20min)
各小组灭菌后需收齐的物品: A培养基 250 mL (分装2个250ml三角瓶) B-G培养基 各30mL (装于6个100mL三角瓶) LB培养基 10mL (分装2个50mL三角瓶, 上交) 空的100mL三角瓶 (1个) 牙签(200只) 枪头(蓝、黄各1盒,) 培养皿(20个) 开始实验先请老师安排试剂配制分工。