一、实验目的

1. 一、实验目的 • 通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法

2. 二、实验原理 • 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列 • 多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象 • 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶 • 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型

3. Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等 • Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式： • 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TTC ……3’ 3’…… C TT|AA’G …...5’ |表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序。‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”

4. 平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来 • Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆 • 影响限制性内切酶活性的因素： • DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值

5. 双酶切的两种酶介绍 • XhoⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点： • EcoRⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：

6. 三、仪器、材料与试剂 • 水浴锅 • 移液枪和枪头 • 制冰机 • 浮板 • R-pGEX-4T-1质粒DNA • XhoⅠ酶 • EcoRⅠ酶 • 10×H Buffer • 无菌水 • 小离心管

7. 四、实验步骤 • 质粒DNA的双酶切 • 反应体系： • 反应条件：温度37℃，酶切1.5h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • 紫外线投射仪观察结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）

8. 五、思考题 • Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎样的末端？ • 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？ ？