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Activación del ciclo celular asociada a muerte neuronal iniciada por daño al DNA. SEMINARIO 4. CÉLULAS EN PROLIFERACION:. Daño al DNA. RELACIÓN. Regulación del Ciclo celular. Apoptosis. Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas. Neuronas asociadas a activación del Ciclo celular

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activaci n del ciclo celular asociada a muerte neuronal iniciada por da o al dna

Activación del ciclo celular asociada a muerte neuronaliniciada por daño al DNA.

SEMINARIO 4

c lulas en proliferacion
CÉLULAS EN PROLIFERACION:

Daño al DNA

RELACIÓN

Regulación del Ciclo celular

Apoptosis

neuronas postmit ticas terminalmente diferenciadas
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas
  • Neuronas asociadas a activación del Ciclo celular
  • Expresión de proteínas relacionadas con el CC.
  • Inhibición de esas proteínas tenía efectos neuroprotectores.
  • Indices mitóticos elevados

Enfermedades neurodegenerativas

Tanto in vivo como in vitro las neuronas comprometidas a la muerte celular.

Capacidad de replicar su DNA.

APOPTOSIS

DAÑO DNA

neuronas postmit ticas terminalmente diferenciadas1
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas

Mayor

sensibilidad

DAÑO DNA

Deficiencia en la

reparación de DNA

neuronas postmit ticas terminalmente diferenciadas2
Neuronas postmitóticas terminalmente diferenciadas

Daño al DNA

RELACIÓN ??

Regulación del Ciclo celular

Apoptosis

hipotesis
HIPOTESIS:

La activación del ciclo celular,

es un componente importante

de la respuesta al daño de DNA,

en neuronas postmitóticas

terminalmente diferenciadas

APOPTOSIS

Reentrada alCC

Agentes genotoxicos

hipotesis1
HIPOTESIS:

La activación del ciclo celular,

es un componente importante

de la respuesta al daño de DNA,

en neuronas postmitóticas

terminalmente diferenciadas

APOPTOSIS

Reentrada alCC

Agentes NO genotoxicos

slide8

Cultivos de corteza cerebral de embriones de rata en dia 18: > 99 % de las cëlulas expresaban MAP 2 ( especifica de neuronas) y GFAP ( celulas de la glia):

  • CITOMETRIA DE FLUJO
slide10

EtoposidoHomocisteinaPeptido β amiloideMetrotexate

AGENTESGENOTOXICOS

EstaurosporinaColchicina

AGENTES NOGENOTOXICOS

hip tesis 1

HIPÓTESIS 1

DAÑO EN EL DNA INDUCE LA PRODUCCION Y ACTIVACION DEL SUPRESOR TUMORAL PROTEINA p53 EN MUCHOS TIPOS CELULARES, INCLUIDAS LAS NEURONAS.

slide12
PROTEINA p53 : es el producto de un gen supresor tumoral que cumple un rol crítico en la respuesta celular al daño del ADN , previniendo así la perpetuación de las mutaciones u otras anomalías cromosómicas en las células hijas.
  • Sus funciones incluyen:

•SENSAR EL ADN DAÑADO

•CONTROLAR LA PROGRESIÓN DEL CICLO CELULAR Y LA APOPTOSIS

•PARTICIPAR EN LA REPARACIÓN DEL ADN.

slide13
El daño al ADN aumenta la capacidad de p53 de activar genes específicos que ayudan a la célula a superar el daño. Además p53 estimula la producción de enzimas que intervienen en la reparación.
  • El ciclo se detiene en G1 y G2 hasta que se repara el daño. Si éste es muy extenso, p53 activa la expresión de genes que conducen a la APOPTOSIS.
hip tesis 2
HIPÓTESIS 2

DAÑO EN EL ADN ACTIVA EL CICLO CELULAR EN NEURONAS, EVIDENCIANDO UN AUMENTO EN LA EXPRESION DE Cdc25A.

slide15
Cdc 25A es un bien establecido regulador de la progresión G1-S y marcador de entrada en fase S , a través de su interacción con el sistema ciclina-CDK.
  • Pertenece a la familia de fosfatasas que incluyen 3 homólogos en mamíferos: Cdc25A, B y C . Se expresa en la fase media de G1 e induce la entrada en S.
expresi n de p53 y cdc 25a en neuronas tratadas con agentes genot xicos versus no genot xicos

EXPRESIÓN de p53 y Cdc 25A en neuronas tratadas con agentes genotóxicos versus no genotóxicos

  • Expresion de p53 y Cdc25A luego de 14hs de tratamiento con Hom, Aβ, Sts.
  • P53
  • Cdc25A
  • Colocalización
slide17
RESULTADO:

FUERTE EXPRESIÓN de p53 y Cdc25A en neuronas corticales expuestas a HOMOCISTEÍNA y Aβ PERO NO A STAUROSPORINA.

se confirm el aumento de expresi n por inmunoblot
Se confirmó el aumento de expresión por inmunoblot
  • Se lisaron las células. Las proteínas fueron separadas por tamaños por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas a una membrana de nitrocelulosa.
  • La membrana se incubó con Anticuerpos primarios contra fosfo-p53 , Cdc25A o Actina.
  • Las membranas fueron expuestas a un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa . Se visualizaron bandas inmunorreactivas por quimioluminiscencia.
  • Se hizo un análisis densitométrico de los blots y se expreso la intensidad de la señal corregida contra los blots de actina como proporción de la señal de control.
se confirm el aumento de expresi n de p53 y cdc25a por inmunoblot
Se confirmó el aumento de expresión dep53 yCdc25A por INMUNOBLOT

INMUNOBLOT MOSTRANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE p53 y Cdc25A

1-Control. 2-St a las 7 hs.

3-Hom a las 7 hs. 4-Aβ a las 7 hs.

5-St a las 18 hs. 6- Hom a las 18 hs.

7- Aβ a las 18hs.

conclusion
Conclusion

LA EXPRESIÓN DE p53 Y Cdc25A EN NEURONAS CORTICALES LUEGO DE LA EXPOSICIÓN A HOMOCISTEÍNA Y Aβ REFLEJA LA RESPUESTA DE LAS NEURONAS AL DAÑO DEL ADN Y LA ACTIVACIÓN DEL CICLO CELULAR RESPECTIVAMENTE

determinaci n de reentrada al cc y replicaci n del dna fase s
Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S)

Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a:

citometr a de flujo
Citometría de Flujo

Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula.

Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente. Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.

fluorocromo propidium iodide pi
Fluorocromo: Propidium iodide (PI)
  • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena.
  • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa.
  • Trabajar con células muertas y fijadas.
  • Excitación en el azul/verde-rojo.

Tinción con PI

10 μg/ml 30 min.

en oscuridad

Fijado

RNAasa

(100 μg/ml)

Citometría de flujo

slide25

Perfiles típicos de distribución del ciclo celular en neuronas corticales de ratones en cultivos Control, con Etopósido y con Staurosporina

slide26
Incremento significativo de neuronas en fase S luego del tratamiento con Metotrexato, Homocisteína y Etopósido.

Con Staurosporina y Colchicina los valores fueron menores que el control.

conclusiones
Conclusiones
  • Los agentes genotóxicos inducen Replicación del DNA en neuronas postmitóticas.
  • Los agentes apoptóticos no genotóxicos no inducen esta reentrada al ciclo celular.
  • Se vió que la supresión de las cdks produce un efecto neuroprotectivo posiblemente por perturbación de la respuesta al daño al DNA y la apoptosis neuronal asociada.
determinaci n de reentrada al cc y replicaci n del dna fase s1
Determinación de reentrada al CC y replicación del DNA (Fase S)

Cultivos de Neuronas Postmitóticas se expusieron a:

citometr a de flujo1
Citometría de Flujo

Técnica que permite medir la cantidad de DNA en forma individual en cada célula.

Fundamento: Unión al DNA de una sustancia fluorescente. Medición a través del citómetro de flujo de la intensidad de la fluorescencia la cual es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que a su vez, es proporcional a la cantidad de DNA presente en la célula.

fluorocromo propidium iodide pi1
Fluorocromo: Propidium iodide (PI)
  • Fluorocromo intercalante del DNA y RNA de doble cadena.
  • Para medir sólo DNA se debe utilizar RNAasa.
  • Trabajar con células muertas y fijadas.
  • Excitación en el azul/verde-rojo.

Fijado

RNAasa

(100 μg/ml)

Tinción con PI

10 μg/ml 30 min.

en oscuridad

Citometría de flujo

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EXPERIMENTO Nº2

OBJETIVO:

Relacionar la inducción a la progresión del ciclo celular con el daño en el ADN y la muerte celular

MATERIALES Y MÉTODOS:

Cultivos de células neuronales corticales entre el día 4 y 8

Agentes genotóxicos: Etoposido, homocisteína, metotrexato, Aβ1-42

Agentes no genotóxicos: colchicina, estaurosporina

Comet assay: cuantificación del daño del ADN

Tinción de Hoechst: cuantificación de la apoptosis

slide36

CONCLUSIONES

AGENTES GENOTÓXICOS

Homocisteína

Metotrexato

Aβ1-42

Etoposido

AGENTES NO GENOTOXICOS

Colchicina

Estaurosporina

Daño al ADN

Apoptosis

No daño al ADN

Apoptosis

slide37

CURVAS CINÉTICAS DE LOS AGENTES UTILIZADOS

A- etoposido 1μM B-Estaurosprina 2μM C-Colchicina 0.5μ

en que momento del ciclo ocurre la apoptosis
En que momento del ciclo ocurre la apoptosis?
  • Cultivo de neuronas
  • Exposición al agente en presencia de BrdU
  • Cosecha
  • Fijación en etanol 70%
  • Tinción multicolor
cuantificaci n simult nea de apoptosis y replicaci n estrategias experimentales
Replicación

Exposición a luz UV

+Ac antiBRdU-PHOENIXRED

Apoptosis

TUNEL: TdT+ BrdUTP-FLUORESCEÍNA

Cuantificación simultánea de apoptosis y replicación Estrategias experimentales
cuantificaci n de apoptosis y replicaci n resultados de la citometr a de flujo
Cuantificación de apoptosis y replicaciónResultados de la citometría de flujo

Porcentaje significativo de replicación ligada a apoptosis

Porcentaje no

significativo

slide41
La citometría de flujo provee una estimación cuantitativa del DNA en cada neurona, demostrando una transición de G1 a S en respuesta al daño por genotóxicos.

En estos casos la reentrada al ciclo celular y la replicación serían un mecanismo crítico que conducirían a la apoptosis.

objetivos
Objetivos
  • Definir la cascada involucrado en respuesta al daño de DNA en neuronas postmitoticas que resulta en la reentrada al CC.
  • Evaluar el % de neuronas apoptoticas, % de neuronas en fase S y daño de DNA en presencia de ATM inhibido y ante la intervencion con distintos agentes que dañan DNA .
slide43
ATM
  • ATM: Proteína del grupo proteinkinasas PIK3.
  • Las PI3K es una serie de proteínas identificadas en varios organismos, las cuales se encuentran involucradas en diferentes checkpoints de la progresión del ciclo celular, respuesta al daño de DNA, en procesos de recombinación y mantenimiento de la estabilidad del genoma.
slide44
El daño de DNA activa a la proteinquinasa ATM, que fosforila a Chk2, para estimular asi su actividad quinasa
  • La Chk2 activada fosforila a la fosfatasa Cdc25A y la marca para su poliubiquitinización.
  • ATM fosforila a p53 en un sitio que interfiere con su union a Mdm2, aumentando su capacidad de activar la transcripción de genes que permitan reparar el daño de DNA ( entre otros p21)
slide45

La supresión de la función de ATM en cultivos de neuronas corticales previene la apoptopsis y activación del ciclo celular inducida por etopósido?

slide47
Se sugiere un rol clave de la vía ATM-Chkd2 en el control en respuesta al daño de DNA, conduciendo a la activación del ciclo celular y apoptosis en neuronas postmitóticas.
  • La inhibición de la función de ATM, tiene un efecto prtector de la apoptosis inducida por etoposido, no siendo asi para staurosporina.
objetivo
Objetivo
  • Evaluar el % de neuronas apoptóticas ante la intervención con Etop Aß y Sts en ratones KO para ATM con respecto a ratones WT.
slide49

Ratones knockout

Genotipificación por

metodología de PCR

slide50

La apoptosis inducida por etoposido o Aß

en cultivo de neuronas de ratones KO

para neuronas fue significativamente

menor comparada con los cultivos de

ratones WT.

No existieron diferencias en la apoptosis

entre los ratones WT y KO

ante la intervención con Sts.

slide51
Objetivo: Determinar el rol en procesos neurodegenerativos de la re-entrada al ciclo secundaria al daño del DNA, en modelos In vivo
  • Ratón transgénico con sobreexpresión de APP (modelo experimental de Alzheimer)
  • En los controles y en los mutantes midieron:
    • Concentración APP
    • Presencia 8 oxodG
    • Actividad enzimática mOGG1
las nucleobases y la deoxiribosas son factibles de oxidaci n generando distintas lesiones 8 oxodg
Las nucleobases y la deoxiribosas son factibles de oxidación generando distintas lesiones: 8 oxodG

8 oxodG se encontró en cerebro postmortem en humanos con Alzheimer

  • Ogg1
  • Pertenece a la superfamilia de endonucleasas III.
  • Tiene función glicosilasa y AP liasa
  • Reconoce 8 oxodG y lo remueve por sistema de Reparación por Excisión de Bases (simil a una de las enzimas del Sistema GO en E. Coli )
slide54

Hallaron relación entre el deposito b Amiloide, el aumento de bases con daño oxidativo y la disminución de la eficiencia enzimática en la remoción de las mismas (Falla en el sistema de Reparación)

conclusiones1
Conclusiones

No se duerman que ya terminamos!!!!

conclusiones2
Conclusiones
  • En células proliferantes, el daño al DNA resulta en la activación de mecanismos que detienen el ciclo celular en checkpoints específicos para dar lugar a la reparación. Sin embargo, si el daño es demasiado extenso para ser reparado, se activa la apoptosis celular.
conclusiones3
Conclusiones
  • En células postmitóticas terminalmente diferenciadas como las neuronas, el daño al DNA induce reentrada al ciclo celular pasando por la fase S. La reentrada al ciclo celular sería un paso indispensable para la activación de la maquinaria de reparación del DNA.
conclusiones4
Conclusiones
  • Otros estudios recientes han demostrado que las enzimas involucradas en la reparación del DNA tienen mayor actividad en las células en proliferación que en las diferenciadas.

Nuclear uracil-DNA glycosilase (UNG) mOgg1 Ku70

conclusiones5
Conclusiones
  • La reentrada al ciclo celular en neuronas diferenciadas puede contribuir a la apoptosis de las células con DNA dañado y no reparado.
  • La reparación del DNA es crítica para el SNC, sin embargo, con estos resultados vemos que las neuronas son más vulnerables al daño al DNA que sus precursores.