slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Лекция 3 : Репарация мтДНК PowerPoint Presentation
Download Presentation
Лекция 3 : Репарация мтДНК

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 51

Лекция 3 : Репарация мтДНК - PowerPoint PPT Presentation


  • 213 Views
  • Uploaded on

http://goo.gl/9acqtM. Лекция 3 : Репарация мтДНК. За день в каждой клетке человека происходит 10 3 -10 6 повреждений ДНК. В человеческом организме около ~ 10 13 клеток. За сутки каждый из нас получает ~ 10 17 повреждений ДНК.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Лекция 3 : Репарация мтДНК' - atara


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

http://goo.gl/9acqtM

  • Лекция 3:
  • Репарация мтДНК
slide2

За день в каждой клетке человека происходит 103-106 повреждений ДНК.

  • В человеческом организме около ~1013клеток.
  • За сутки каждый из нас получает ~1017повреждений ДНК.
slide3

С возрастом частота мутаций в мтДНК увеличивается примерно в 5 раз к 80ти годам.

PMID:24086148

slide4

МтДНК мутирует быстрее ядерной

  • Почему?
  • в митохондриях повышенное содержание ROS
  • в митохондриях более слабый аппарат репарации
  • в митохондриях менее точный аппарат репликации
slide5

Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА

В нормальной человеческой клетке:

0.3-4.2 8oxoG/106 G,

что соответствует

7.7х104 – 1х105 8oxoG

в одной клетке

slide6

Частота разных типов мутаций в мтДНК

PMID:24086148

  • Частота трансверсии G ->T практически не увеличивается с возрастом также как и все остальные трансверсий, в отличии от транзиций.
  • Транзиция — одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином).
  • Трансверсия — пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот.
slide7

Количество мутаций в мтДНК увеличивается с возрастом не за счет образования 8охоG под действием окислительного стресса.

slide8

Как распределены мутации по мт геному?

В области D-loop мутаций больше, чем в остальном геноме.

Но относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему мт геному и не меняется с возрастом.

Видимо, уже при рождении мутаций в D-loop больше.

slide9

Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?

Замены

G ->A и Т->С

чаще

происходят в

L-цепи, чем в

Н-цепи

по всему

мт-геному,

но не D-loop.

slide10

Это можно объяснить асинхронной репликацией мтДНК: материнская Н-цепь остается в оц состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на матрице L-цепи.

В одноцепочечном состоянии в Н-цепи происходит спонтанное дезаминирование цитозина с образованием тимина и аденина с образованием гуанина.

slide11

За счет чего растет частота мутаций в митохондриях?

  • Возникает спонатнное дезаминирование С и А особенно в одноцепочеченых участках ДНК в ходе репликации
  • ДНК полимераза γ ошибается в репликации
  • Возможно, 8охоG удаляется до репликации или его репарация усиливается с возрастом
slide12

Виды репарации

  • Изменение в одной цепи ДНК:
  • BER – base excision repair:замена измененного в результате окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования азотистого основания
  • MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов
  • NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений правильной двуцепочечной структуры ДНК (например, пиримидиновых димеров)
slide13

Изменения в обеих цепях ДНК

(Double-strand break repair):

  • NHEJ – non-homologous end joining:DNA ligase IV использует ближайшие выступающие концы ДНК для присоединения к месту разрыва и его сшивания. Этот процесс приводит к серьезным нарушениям в геноме
  • HR – homologous recombination:для восстановления структуры ДНК в качестве матрицы используются гомологичные хромосомы
slide15

Репарация митохондриальной ДНК.

PMID: 22138376

  • BER – base excision repair
  • MMR – mismatch repair
  • NER – nucleotide excision repair
  • NHEJ – non-homologous end joining
  • HR – homologous recombination
slide16

Base excision repair (BER) в митохондриях:

  • SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER
  • – заменяется 1 нуклеотид
  • LP (long patch) BER
  • – заменяется 2-6 нуклеотидов
slide17

Base excision repair (BER) в митохондриях:

PMID:20950654

  • Специфичная ДНК-гликозилаза перемещает поврежденное основание ДНК
  • АP-эндонуклеаза (от apurinic or apyrimidinic site)расщепляет цепь ДНК, оставляя единичный разрыв, содержащий 5’-dRP-группу.
  • Вместо удаленного нуклеотида ДНК-полимераза вставляет новый (ые).
  • Лигаза зашивает цепь ДНК.
slide18

SN BER: 5’-dRP-группа удаляется, а gap заполняет DNA pol γ, затем сшивает DNA ligase III

  • Скорость dRP-лиазной реакции у DNA pol γ ниже, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.
  • LP BER проходит в экстрактах митохондрий в присутствии белков:
  • Хеликаза DNA2 процессирует расширяющуюся flap-структуру
  • Flap endonuclease FEN1 удаляет flap-структуру, замененную DNA pol γ
  • Ligase III сшивает разрыв
slide19

Основные виды повреждений азотистых оснований:

  • Окисление
  • Алкилирование
  • Дезаминирование
slide20

Base excision repair (BER) в митохондриях:

Поврежденные азотистые основания удаляются

специфичными гликозилазами

slide21

Основные продукты окисления азотистых оснований

slide22

Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8охоG и 8охоА

В нормальной человеческой клетке:

0.3-4.2 8oxoG/106 G,

что соответствует

7.7х104 – 1х105 8oxoG

в одной клетке

slide23

Репарацию 8oxoGосуществляет гликозилаза OGG1(MutM у бактерий).

  • Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько изоформ фермента, в том числе и митохондриальную.
  • В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, в митохондрии их нет:
  • В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitroне вырезается 8oxoG.
  • У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно, в митохондриях гораздо сильнее.
  • MYH (MutYу бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG.
  • Альтернативный сплайсинг дает ядерную и митохондриальную изоформы MYH.
slide24

Образование тимингликоля из тимина под действием окислительного стресса блокирует работу РНК- и ДНК-полимеразы

slide25

Тимингликольудаляется тимингликоль-гликозилазой.

У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1 двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2 образует ядерную изоформу.

PMID:10207101

slide26

Совместно с NTG1 в дрожжевых митохондриях при BER-репарации работает хеликаза PIF1.

Совместное потеря генов NTG1, PIF1 и SOD (супероксиддисмутаза) приводит к потере мтДНК.

Это доказывает, что повреждения от окислительный стресса вносят основной вклад в геномную нестабильность митохондриального генома дрожжей.

PMID:15923634

slide27

Для тимингликоль-гликозилазы МлекопитающихhNTHL1 данные противоречивы:

  • по одним данным она локализована в ядре и митохондриях, по другим – только в ядре.
  • удаление тимингликоля не происходит в митохондриях из клеток мышей nth-/-, но в то же время другой группой показано удаление тимингликоля в экстрактах митохондрий мышей nth-/-.
slide29

Удаление урацила, образованного при дезаминировании цитозина, осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза

Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНК-гликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного гена и в результате альтернативного сплайсинга.

У дрожжей одна изоформа этого фермента, в нем есть сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации.

PMID:9016624

UNG2

UNG1

slide30

Наиболее распространенные продукты алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG

slide31

Алкилированные основанияудаляет

N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3-methyladenine-DNA-glycosylase).

Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в митохондриях репарируются повреждения, обычно служащие субстратами этого фермента.

slide32

Base excision repair (BER) в митохондриях:

АР эндонуклеазы

Основная АР эндонуклеаза МлекопитающихАРЕХ1 локализована как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза АРЕ2, частично транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность низка, функции требуют дальнейшего изучения.

У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии, взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1 конкурирует с ядерными белками за связывание с сигналом ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в митохондрии.

slide33

Base excision repair (BER) в митохондриях:

застраивание бреши и лигирование

АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3’-конце бреши, но механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа расположена на 5’-конце.

В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.

slide34

В случае, если АР эндонуклеаза и ДНК-полимераза может оставить на 5’-конце фосфат, репарация идет по механизму short patch BER– вставляется только один нуклеотид.

В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности ДНК-полимеразы (например, при образовании 2-deoxyribonolactone) - репарация идет по механизму long patchBER– вставляется 2-6 нуклеотидов.

slide35

Base excision repair (BER) в митохондриях:

PMID:20950654

Считается, что в long patchBERв митохондриях участвуют FEN1 и хеликаза DNA2.

Последняя стадия BER-репарации – лигирование. В митохондриях человека лигирование проводит DNA ligase 3(LIG3). У дрожжей в митохондриях работает LIG1.

slide36

Регуляция BER

PMID:20950654

PMID:20950654

  • ROS, образованные вне митохондрии или в результате утечки электронов из ЭТЦ повреждают свободные dNTP и мтДНК.
  • Сигнал о повреждении поступает в цитозоль, белки системы репарации транспортируются в митохондрию (возможно, за счет посттрансляционных модификаций).
  • Передача сигнала о повреждении мтДНК может дополняться передачей сигнала о повреждении ядерной ДНК для перераспределения факторов репарации. Происходит изменение локализации OGG1, UNG1 и NTH1 и дрожжевого NTG1.

Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым.

slide37

Основные пути репарации в митохондриях:

  • Уничтожение окисленных dNTPs (I)
  • Short-patch BER (II)
  • Long patch BER (III)
  • Регуляция репарационных процессов (IV-V)

Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым;ДНК связывающие белки выделены серым.

slide38

Factors from cytoplasm

ROS

TFAMучаствует в репарации мтДНК. TFAM связывается с поврежденной ДНК прочнее, чем с интактной. У TFAM аффинность к ДНК, содержащей 8-охоG, выше, чем у гликозилаз OGG1 и MYH.

Клетки, устойчивые к циспластину (алкилирующий агент), гиперэксперессируют TFAM и TRX2 (тиоредоксин 2).

TFAM связывается с р53, который тоже может регулировать его связывание с ДНК в зависимости от вида повреждения.

3’-5’ экзонуклеазная активность р53 может удалять 8-охоG на 3’-конце, эта реакция усиливается SSB.

slide39

1. В митохондриях происходит репарация BER двух типов:

  • SP (short patch) BER
  • LP (long patch) BER
  • 2. Основные стадии BER:
  • Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание
  • АР-эндонуклеаза освобождает 3’-конец бреши
  • В зависимости от группы на 5’-конце бреши ДНК полимераза ɣ застраивает брешь одним (SP BER) илинесколькими (LP BER) нуклеотидами.
  • FEN1 и DNA2 участвуют в LP BER
  • LIG 3 зашивает разрыв
  • 3. Существует регуляция BER в митохондриях:
  • Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на сигналы о повреждениях
  • В репарации BER участвуют TFAM и p53
slide40

Удаление несоответствий и небольших петель. Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит верный выбор материнской цепи, что приводит к мутациям.

Удаление несоответствий - некомплементарных пар G:T и G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих.

Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1,предполагается, что он является ключевым компонентом MMR и в митохондриях.

MMR – mismatch repair

slide41

YB-1 в отличие от остальных участников ядерной MMR (MSH1, MSH3, MSH6) частично локализован в митохондриях.

В митохондриальных экстрактах из клеток с отсутствием MSH2 наблюдается MMR => механизм MMR в митохондриях отличается от ядерного.

MMR в экстрактах митохондрий снижается при уменьшении уровня YB-1 (нокдаун siRNA).

PMID:19272840

slide42

Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается открытым.

  • BER тоже может репарировать несоответствия.
  • Существует предположение, что MMR необходима для удаления маленьких петель в большей степени, чем несоответствий в парах нуклеотидах.
slide43

Double-strand break repair

Есть доказательства наличия в митохондриях обоих механизмов:NHEJ (non-homologous end joining)и

HR (homologous recombination).

RAD51 – основной фермент HR в ядре – локализован также в человеческих митохондриях

:

slide44

Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на окислительный стресс.

Для перехода Rad 51 необходима репликация.

PMID:23591384

slide45

Direct repair (без разрезания фосфодиэфирной связи)

Повреждения ДНК УФизлучением в ядре репарирует фотолиаза, её активность не показана в митохондриях Млекопитающих. У дрожжей фотолиаза работает в митохондриях.

O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) – основной фермент прямого репарирования алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть данные, что MGM присутствует в митохондриях, но может репарировать только метилированные и этилированные основания.

slide46

NER – nucleotide excision repair

  • Считается, что этот механизм отсутствует в митохондриях.
  • В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые димеры репарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на NER.
  • Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne Syndrome) и CSB обнаруживаются в митохондриях Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и компонентами BER.
  • Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм NER, который еще будет исследован.
slide47

В митохондриях происходит репарация двух типов:

  • BER – base excision repair
  • MMR – mismatch repair
  • 2. В митохондриях отсутствует NER – nucleotide excision repair
  • 3. Наличие репарации при двуцепочеченых повреждениях мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии в условиях окислительного стресса и участвует в репликации.
slide48

Регуляция и топология репарации в митохондриях

  • CSB (от Cockayne Syndrome) рекрутирует факторы BER к мембране;
  • CSA and CSB взаимодействуют с SSB и гликозилазой;
  • p53 стимулирует гликозилазу и POLγ;
  • PARP-1 модулирует BER.

PARP1– Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER, поэтому PARP1 влияет и на BER.

PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.

slide49

Мт ДНК связана с внутренней мембраной. Один из белков, связывающих ДНК с мембраной – М19, вероятно, участвуют также РНВ1 (prohibitin1)и ATAD3 (белок внутренней мембраны, ответственный за перемещения D-loop).

Большинство компонентов BER связаны с внутренней мембраной (кроме АР-эндонуклеазы). Но стабильного комплекса компоненты BER не образуют. Есть данные, что CSB вовлечен в сборку и сохранение комплекса мтДНК и компонентов BER: он связывает SSB и OGG1 в один комплекс с мтДНК.

slide50

Есть две модели:

  • мтДНК мобильна и проходит через комплексы, расположенные на внутренней мембране, для репликации, репарации и. т. д.
  • мтДНК заякорена на внутренней мембране.
slide51

Регуляция репарации мтДНК

Мт изоформы многих ферментов мт репарации образуются с помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна посттранскрипционная регуляция.

Есть данные по NTG1 и NTG2 дрожжей. NTG1 динамично перераспределяется между ядром и митохондриями при окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из митохондрий.

Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB.

Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1, является общим.

Окислительный стресс вызывает переход р53 в митохондрии.