1 / 63

选修一 生物技术实践 专题 5 DNA 和蛋白质技术 课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段

选修一 生物技术实践 专题 5 DNA 和蛋白质技术 课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段. 阜阳市 阜南一中 杨金立. 教学目标. 重点难点. 问题探讨. 教学过程. 知识结构. 教学反馈. 课后习题. 教学参考. 课题 2 多聚酶链式反应 扩增 DNA 片断. 【 课题目标 】. （一）知识与技能 1 、了解 PCR 技术的基本操作 2 、理解 PCR 的原理 3 、讨论 PCR 的应用 （二）过程与方法

astra-parker
Download Presentation

选修一 生物技术实践 专题 5 DNA 和蛋白质技术 课题 2 多聚酶链式反应扩增 DNA 片段

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 选修一 生物技术实践专题5 DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段 阜阳市 阜南一中 杨金立 教学目标 重点难点 问题探讨 教学过程 知识结构 教学反馈 课后习题 教学参考

  2. 课题2 多聚酶链式反应 扩增DNA片断

  3. 【课题目标】 （一）知识与技能 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 （二）过程与方法 　 在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件 （三）情感、态度与价值观 通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神

  4. 【课题重点与难点】 • 课题重点： PCR的原理和PCR的基本操作。 • 课题难点： PCR的原理。

  5. 美国科学家　穆利斯(K.B.Mullis) 发明了PCR技术　1993年诺贝尔奖 ★　分子生物学研究中最强大的实验技术之一 ★　其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程

  6. 一、多聚酶链式反应 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。 　　能以极少量的DNA为模板，在几小时内 复制出上百万份的ＤＮＡ拷贝。 　　广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、 古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。

  7. 脱 氧 核 苷 酸 磷酸 脱氧核糖 腺嘌呤（A） 脱氧核苷 嘌呤 含氮 碱基 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 嘧啶 胸腺嘧啶（T） 二、DNA分子的结构 1、基本组成单位——脱氧核苷酸

  8. 5 3 脱氧核苷酸结构式

  9. 2、多脱氧核苷酸链的形成 　　一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的 3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。 数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3'，5'-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。 通常将DNA的羟基 “－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。

  10. 5’ OH 碱基 5’ 碱基 O HO O P 脱氧核糖 O 3’ 磷酸基团 O 碱基 碱基 5’ O HO O P 脱氧核糖 O 3’ OH 碱基 脱氧核糖 3’ 多脱氧核苷酸链结构简图

  11. C A A T G C T G DNA单链两端的命名 3，端 5，端含磷酸基团 连 接 3，端（含羟基） 5，端

  12. 3、DNA分子的双螺旋结构特点 ① DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构。 ②脱氧核糖与磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键连接起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对。

  13. 三、DNA的复制 1、概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 2、时期 有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期 3、场所 细胞核（主）（线粒体、叶绿体） 4、模板 DNA母链

  14. 5、原材料 脱氧核苷酸 6、基本条件 酶、ATP、原料、模板 7、复制过程 ① DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链 ② RNA引物的合成 　　以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。

  15. ③ DNA的生成 　　以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。 8、复制特点 边解旋边复制(过程） 半保留复制（结果） 9、遵循原则 碱基互补配对原则

  16. 10、精确复制的原因 ①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 ②碱基互补配对保证了复制准确无误的进行 11、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。

  17. 总结：胞内DNA复制的基本体系 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸

  18. 四、 PCR(多聚酶链式反应） 1、 PCR原理 ①在80－100℃的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

  19. 加热到95℃，DNA双链 解旋为单链 变性 降到55℃，引物通过碱基 互补配对与单链DNA结合 复性 升温到72℃，四种脱氧核苷酸 在DNA聚合酶的作用下，根据 碱基互补配对原则合成新的DNA链 延伸

  20. 2、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 细胞内源 引物合成酶 细胞内源 细胞内源 细胞内环境 外源加入 外源加入 外源加入 外源加入 缓冲液

  21. 3、细胞内复制和PCR的主要不同点 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。 ② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

  22. 4、 DNA聚合酶特性 　　不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物。 5、 DNA聚合酶作用过程 　　当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

  23. 6、 Taq DNA聚合酶的应用 　　高温解决了打开双链的问题， 　　但又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活，促成了PCR技术的自动化。 7、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

  24. 8、 PCR技术的特点 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、 简便、重复性好、易自动化等特性。

  25. 五、 PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸 2、循环过程 ①变性（模板DNA解旋） 　　模板DNA经加热至950C左右。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

  26. 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步：高温变性

  27. ②复性（退火）——低温复性 　　模板DNA经加热变性成单链后，温度降到550C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

  28. PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列

  29. ③延伸 ——中温延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合 酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为 模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制 的原理，合成一条新的DNA链。

  30. PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ 引物Ⅰ Taq DNA 聚合酶 引物Ⅱ 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列

  31. 第1个PCR循环完成后 ：得到两个靶序列 靶序列 靶序列

  32. 95℃变性 （1）PCR循环--变性

  33. （1）PCR循环--变性 95℃变性

  34. （1）PCR循环--变性 95℃变性

  35. 55℃复性 （2）PCR循环—复性

  36. （3）PCR循环—延伸

  37. （3）PCR循环—延伸

  38. （3）PCR循环—延伸

  39. （3）PCR循环—延伸

  40. 循环特点： ①上一次循环的产物为下一循环的模板 ②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代DNA分子中 ③其它子代DNA分子都为双引物分子式 ④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N

  41. 3、30次循环后靶序列扩增的数量

  42. 六、 PCR 的实验操作 （一）设备及用具 1、PCR仪 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

  43. PCR仪 微量离心管

  44. 推动按钮 微量移液器 调节轮 卸枪头按钮 一 次 性 吸液枪头 卸枪头器

  45. （二）实验操作步骤 ①准备好PCR反应体系的配方 ②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分 ③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁 ④离心10分钟 ⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序 ⑥电泳检测PCR结果

  46. （三）、操作提示： • 1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。 • 2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 • 3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 目的： 避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。

  47. 七、课题成果评价 （一）理论上DNA扩增数目的计算 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2n 2 、a条DNA，复制n次， DNA为 a×2n （二）实验中DNA含量的测定原理 　　可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

More Related