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第二十二章

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第二十二章. 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application. 生物科学与技术学院. 第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology. 一、分子杂交与印迹技术的原理. 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ). 复性. RNA. DNA. 核酸分子杂交的原理.

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第二十二章

常用分子生物学技术的原理及应用

The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application

生物科学与技术学院

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一、分子杂交与印迹技术的原理
  • 核酸分子杂交
  • (nucleic acid hybridization )
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复性

RNA

DNA

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核酸分子杂交的原理

带有某种标记的核酸单链作为探针,在一定条件下, 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体, 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。

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核酸分子杂交的杂交动力学

核酸分子杂交

核心序列形成

自发过程

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(一)印迹技术

(二)探针技术

  • 探针 (probe)
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探针的来源
  • 基因组DNA探针
  • cDNA探针
  • RNA探针
  • 寡核苷酸探针
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二、印迹技术的类别及应用

(一)DNA印迹技术(Southern blotting)

(二)RNA印迹技术(Northern blotting)

(三)蛋白质的印迹分析(Western blotting)

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其他
    • 斑点印迹 (dot blotting)
    • 原位杂交(in situ hybridization)
    • DNA点阵 (DNA array)
    • DNA芯片技术 (DNA chip)
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Southern Blot 操作步骤:

DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交

杂交(变性探针) 洗膜 放射自显影或显色

dot blot
斑点印迹杂交(Dot blot)

斑点印迹

优点-----简单、迅速;核酸粗提、多样品检测

缺点-----不确定分子量、特异性不高,假阳性

in situ hybridization
原位杂交 (In Situ hybridization)

标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。

1969, Pardue --爪蟾核糖体基因探针

1970, Orth ---兔乳头状瘤病毒cDNA探针

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操作过程
  • SDS-PAGE电泳 转膜(PVDF或硝酸纤维素膜)
  • 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应
  • 洗涤 显色或化学发光显影
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Hours 0 4 8 16

Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3/Bcl-2. Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

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注意的问题
  • 蛋白质电泳
  • 常用SDS-PAGE
  • 非变性PAGE
  • Tris-Tricine胶中电泳

聚丙烯酰胺具有神经毒性,操作时要戴手套

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分子杂交实验

目 录

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DNA芯片

DNA芯片: (Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip)

特点:高度并行性,多样性,微型化和自动化。

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Genomic

Expression

1. Extract genomic

DNA from tissue

1. Extract mRNA

from tissue

Tumor

Sample

2. Produce cDNA by

RT & Label

2. Label

3. Mix with labeled

reference cDNA

3. Mix with labeled

reference DNA

4. Hybridize to Chip

4. Hybridize to Chip

5. Wash and Image

5. Wash and Image

Assay Formats

Normal

Sample

research use from sequence to function
Research Use——From Sequence to function

计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5)

  • 在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。

Clustering

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DNA点阵

目 录

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DNA芯片技术的主要应用

① 分析基因组、发现新基因

② 基因表达的研究

③ DNA序列分析

④ 基因诊断

⑤ 基因药物设计

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PCR技术发展简史

(1)PCR的最早设想

(2)PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

(3) PCR的改进与完善 

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耐热的DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。基因全长2,499bp,编码分子量为94 kd、长度为832个氨基酸的蛋白质。

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聚合酶链式反应(PCR)原理

PCR是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程,即利用DNA 聚合酶(如Taq DNA聚合酶)等在体外条件下,催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。

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Cycle 1

5

5

5

5

5

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Cycle 2

5

5

5

5

5

5

一、基本工作原理

Template DNA

Primer 1

5

5

5

Primer 2

5

目 录

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5

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5

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5

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25~30 次循环后,模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。

Cycle 3

目 录

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二、PCR体系基本组成成分
  • 模板DNA
  • 特异性引物
  • 耐热DNA聚合酶
  • dNTPs
  • Mg2+
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三、PCR的基本反应步骤

变性

95˚C

退火

Tm-5˚C

延伸

72˚C

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平台期与平台效应(plateau effect)

PCR经过一定数量的循环后,随着产物的对数累积趋于饱和,DNA片段不再呈指数积累,而是进入线性增长期或静止期,此过程称为平台效应。

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PCR通用操作程序

①向一微量离心管中依次加入:双蒸水补至终体积(终体积20~100μl)

10×PCR缓冲液1/10体积

2mmol/L dNTP 1/10体积

引物各10~50pmol

DNA模板102~105拷贝

Taq DNA聚合酶0.2~2.5U

混匀后,离心数秒。

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②加矿物油50~100μl于反应液表面

以防蒸发,于PCR仪上设置程序,置反应

管于PCR仪上,进行热循环。

③琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

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四、PCR的主要用途

(一)目的基因的克隆

(二)基因的体外突变

(三)DNA和RNA的微量分析

(四)DNA序列测定

(五)基因突变分析

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三、几种重要的PCR衍生技术

(一)反转录PCR技术

(二)原位PCR技术

(三)实时PCR技术

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原位PCR(In-situ PCR)

原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。

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核酸序列分析的基本原理

化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)

DNA链的末端合成终止法 (sanger法)

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一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)

基本原理

基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性,精确地控制反应强度,使一个断裂点仅存在于少数分子中,不同分子在不同位点断裂,从而获得一系列大小不同的DNA片段,将这些片段经电泳分离。

分析前,用同位素标记DNA的5´末端,经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。

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三、DNA自动测序

采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸,然后进行Sanger测序反应,反应产物经电泳分离后,检测器采集荧光信号,并依此确定DNA碱基的排列顺序。

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基因文库 (gene library)

是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。

  • 基因组DNA文库 (genomic DNA library)
  • cDNA文库 (cDNA library)
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克隆疾病相关基因的策略

(一)功能性克隆(functional cloning)

(二)定位克隆(positional cloning)

(三)非定位候选基因克隆策略(position-

independent candidate gene approaches)

(四)定位候选基因克隆策略(positional

candidate gene approaches )

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(一)功能性克隆
  • 定义
    • 从对一种致病基因的功能的了解出发,克隆该致病基因。
  • 应用
    • 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。
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克隆方式

① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库;

② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针,筛选cDNA文库。

  • 功能互补试验 (functional complementation assay)
    • 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
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(二)定位克隆
  • 定义
    • 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围,最后克隆该基因。
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(三)非定位候选基因克隆策略

由于基因组作图的完成和分子病理学的发展,人们可以不依靠染色体定位,直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解,预测出候选致病基因。

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(四)定位候选基因克隆策略

当致病基因的染色体定位确认后,人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据,鉴定出候选致病基因。

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第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用

The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model

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一、转基因技术
  • 转基因技术
    • 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞,然后将细胞导入动物子宫,使之发育成个体。
  • 转基因——被导入的目的基因
  • 转基因动物(transgenic animal)
    • ——目的基因的受体动物
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二、核转移技术

核转移技术

即动物整体克隆技术,将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内,使之发育成个体,即克隆(clone)。

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三、基因剔除技术
  • 基因剔除技术
    • 也称基因靶向(gene targeting)灭活,有目的去除动物体内某种基因的技术。
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四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用

建立动物模型

① 单基因决定疾病模型

基因剔除

获得性突变(gain-of-function mutation)

② 多基因决定疾病模型

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第 七 节

生 物 芯 片 技 术

Biological Chip Technology

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一、基因芯片

基因芯片(gene chip)

  • DNA芯片(DNA chip)
  • cDNA芯片(cDNA chip)
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二、蛋白质芯片

蛋白质芯片(protein chip)

是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上,当与待测蛋白样品反应时,可捕获样品中的靶蛋白,再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。

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第 八 节

蛋白质相互作用研究技术

Research Technology of Interaction of Protein

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蛋白质之间相互作用研究的重要性

蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动,包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等,都离不开蛋白质之间的相互作用。

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常用蛋白质相互作用的研究技术

酵母双杂交

各种亲和分析(亲和色谱、免疫共沉淀等)

荧光共振能量转换效应分析

噬菌体显示系统筛选等等

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Gal4激活域

LacZ

Gal4结合域

双杂交系统的原理

X

Gal4结合域

LacZ

Gal4激活域

Y

LacZ

Gal4激活域

Y

X

LacZ

Gal4结合域

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二、酵母双杂交系统的应用

(一)分析已知蛋白之间的相互作用

(二)对蛋白质功能域的分析

(三)分析未知蛋白相互作用

(四)绘制蛋白质相互作用系统图谱

(五)在药物设计中的应用

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