第二十二章

1. 第二十二章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 生物科学与技术学院

2. 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology

3. 一、分子杂交与印迹技术的原理 • 核酸分子杂交 • (nucleic acid hybridization )

4. 复性 RNA DNA

5. 核酸分子杂交的原理 带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下， 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子大小或进行靶序列的相对定量分析。

6. 核酸分子杂交的杂交动力学 核酸分子杂交 核心序列形成 自发过程

7. （一）印迹技术 （二）探针技术 • 探针 (probe)

8. 探针的来源 • 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 寡核苷酸探针

9. 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术(Southern blotting) （二）RNA印迹技术(Northern blotting) （三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)

10. 其他 • 斑点印迹 (dot blotting) • 原位杂交(in situ hybridization) • DNA点阵 (DNA array) • DNA芯片技术 (DNA chip)

11. 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 核酸杂交技术 • （一）Southern Blot 原理

12. Southern Blot 操作步骤： DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色

14. 斑点印迹杂交(Dot blot) 斑点印迹 优点-----简单、迅速；核酸粗提、多样品检测 缺点-----不确定分子量、特异性不高，假阳性

15. 原位杂交 （In Situ hybridization） 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue --爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth ---兔乳头状瘤病毒cDNA探针

16. Western Blot 原理

17. 操作过程 • SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） • 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 • 洗涤 显色或化学发光显影

18. Hours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3/Bcl-2. Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.

19. 注意的问题 • 蛋白质电泳 • 常用SDS-PAGE • 非变性PAGE • Tris-Tricine胶中电泳 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套

20. 三种印迹技术的比较

21. ② ③ ① 分子杂交实验 目 录

22. 放射自显影照片 目 录

24. DNA芯片 DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip) 特点：高度并行性，多样性，微型化和自动化。

25. Genomic Expression 1. Extract genomic DNA from tissue 1. Extract mRNA from tissue Tumor Sample 2. Produce cDNA by RT & Label 2. Label 3. Mix with labeled reference cDNA 3. Mix with labeled reference DNA 4. Hybridize to Chip 4. Hybridize to Chip 5. Wash and Image 5. Wash and Image Assay Formats Normal Sample

26. DNA micrarray robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment.

29. Research Use——From Sequence to function 计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5) • 在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。 Clustering

30. 芯片杂交结果示意图

31. DNA点阵 目 录

32. DNA芯片技术的主要应用 ① 分析基因组、发现新基因 ② 基因表达的研究 ③ DNA序列分析 ④ 基因诊断 ⑤ 基因药物设计

33. 第 二 节聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction

34. PCR技术发展简史 (1)PCR的最早设想 (2)PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 (3) PCR的改进与完善　

35. 耐热的DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。基因全长2,499bp，编码分子量为94 kd、长度为832个氨基酸的蛋白质。

36. 聚合酶链式反应(PCR)原理 PCR是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程,即利用DNA 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。

37. Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Cycle 2 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理 Template DNA Primer 1 5 5 5 Primer 2 5 目 录

38. 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 Cycle 3 目 录

39. 二、PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • Mg2+

40. 三、PCR的基本反应步骤 变性 95˚C 退火 Tm-5˚C 延伸 72˚C

41. PCR thermal cyclers

42. 平台期与平台效应（plateau effect） PCR经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。

43. PCR通用操作程序 ①向一微量离心管中依次加入：双蒸水补至终体积（终体积20～100μl） 10×PCR缓冲液1/10体积 2mmol/L dNTP 1/10体积 引物各10～50pmol DNA模板102～105拷贝 Taq DNA聚合酶0.2～2.5U 混匀后，离心数秒。

44. ②加矿物油50～100μl于反应液表面 以防蒸发,于PCR仪上设置程序，置反应 管于PCR仪上，进行热循环。 ③琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

46. 四、PCR的主要用途 （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析

47. 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术

48. 原位PCR(In-situ PCR) 原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。

49. 实时PCR技术原理 目 录

50. 第 三 节核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis