TRANSCRIÇÃO

1. TRANSCRIÇÃO Biologia Molecular Profª Marília Scopel Andrighetti

2. Dogma central O fluxo da informação é unidirecional

3. TRANSCRIÇÃO DO DNA • Processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA fita dupla; • Processo bastante variável para atender as necessidades fisiológicas da célula; • Apenas uma das fitas é utilizada como molde para a síntese do RNA (fita molde direção 3’→5’). A outra fita é idêntica à fita de RNA sintetizada (fita codificadora direção 5’→3’), com a substituição de T por U;

4. Fitas molde e codificadora

5. O molde é local Genes podem ser transcritos utilizando uma das fitas de DNA como molde, enquanto outros podem utilizar a outra fita do DNA. A escolha da fita molde depende da localização e orientação do promotor

6. TRANSCRIÇÃO DO DNA • RNA informacional: RNA mensageiro. Sempre é codificado em polipeptídeos pela tradução; • RNA funcional: nunca são traduzidos em polipeptídeos e sua ação é puramente no nível de RNA. Ex: tRNA, rRNA, e outros pequenos RNA's; • Síntese do RNA: RNA polimerase + ribonucleosídeos trifosfatados.

7. A maquinaria de transcrição

8. ATIVIDADES DA RNA POLIMERASE • Reconhecem e ligam-se em sequências específicas do DNA; • Desnaturam o DNA na altura dos nucleotídeos que serão transcritos; • Mantém as fitas de DNA separadas na região de síntese; • Estabiliza o híbrido DNA:RNA na síntese; • Renatura o DNA imediatamente após a síntese; • Termina a síntese sozinha, ou com ajuda de proteínas.

9. RNA POLIMERASE - EUCARIOTOS • RNA polimerase I – localizada no nucléolo e responsável pela síntese do RNA ribossômico; • RNA polimerase II – localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA mensageiro; • RNA polimerase III – também localizada no nucleoplasma e responsável pela síntese do RNA transportador.

10. RNA POLIMERASE - PROCARIOTOS

11. TRANSCRIÇÃO DO DNA • A ligação ocorre entre o ribonucleotídeo presente e o fostato do C5’ do ribonucleosídeo trifosfatado a ser incorporado; • A RNA polimerase não necessita de primer para iniciar a síntese.

12. Não é que parece com a replicação?

13. TRANSCRIÇÃO DO DNA • INÍCIO Reconhecimento de sequências específicas no DNA • ALONGAMENTO Incorporação dos ribonucleotídeos • TERMINAÇÃO Sequências no DNA são reconhecidas e a síntese é interrompida

14. INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO • O DNA apresenta sequências específicas, denominadas PROMOTORES, que sinalizam exatamente onde a síntese do RNA deve ser iniciada; • São sequências de 100 a 200 nucleotídeos próximos ao sítio de início da transcrição; • Os promotores são, primeiramente, reconhecidos por fatores de transcrição que, ligados ao DNA, interagem com outros fatores, formando um complexo ao qual a RNA polimerase se associa; • A RNA polimerase liga-se frouxamente à dupla fita de DNA e reconhece o promotor.

15. INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO • No promotor, 2 sequências são altamente conservadas: a -10 (TATAAT) e a -35 (TTGACA), as quais separam-se por, aproximadamente 17 nucleotídeos; • O primeiro nucleotídeo a ser transcrito é geralmente uma purina – A ou G; • A região -10 recebe o nome de TATAbox; • Elementos “enhancer” ou amplificadores são sequências pequenas de DNA que podem ocorrer na região 5’ do gene, as quais ativam a expressão do mesmo.

16. INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO • A holoenzima RNA polimerase liga-se especificamente nas regiões -10 e -35 em uma das faces da dupla fita (fita molde). Essa ligação ocorre na cavidade maior do DNA, onde as bases estão acessíveis a proteínas.

18. INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO • Após a ligação da RNA polimerase, forma-se o complexo de iniciação da transcrição; • O complexo abre-se formando a bolha de transcrição; • Essa abertura ocorre na região -10 (TATAbox) a qual é rica em AT.

19. INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO Ocorre a incorporação de 2 primeiros ribonucleotídeos e a formação da ligação fosfodiéster; Após, a enzima sintetiza alguns oligonucleotídeos de 2 a 9 pb; Enquanto o fator  permanece ligado na enzima (fator que reconhece o sítio de início da transcrição), a enzima não se desloca; Depois que o fator  se desliga, a enzima fica livre para se deslocar e iniciar a fase de alongamento; O promotor e o fator  ficam livres para iniciar outro ciclo de transcrição.

20. Subunidade Sigma -- σ A subunidade sigma da RNA polimerase é fundamental para o reconhecimento específico da região promotora. Ela, juntamente ao cerne da enzima, desliza ao longo do DNA à procura do promotor, não precisando desenrolar a dupla hélice.

21. Sigma na iniciação da transcrição

22. E onde fica o RNA? É feito no núcleo e depois vai para o citoplasma Mas procarioto não tem núcleo... Por isso se diz que suatranscrição é acoplada com a tradução

24. Eucariotos O RNA vai para o citoplasma

25. Transcrição em procariotos

26. ALONGAMENTO DA CADEIA • A polimerase desliza ao longo da fita molde estendendo uma cadeia de RNA crescente no sentido 5’3’ através da adição de ribonucleotídeos; • Durante o alongamento, 18pb estão desnaturados e 12pb formam um híbrido DNA:RNA; • O deslocamento da RNA polimerase gera superenrolamento positivo à frente da bolha de transcrição e negativo atrás da mesma, sendo necessárias topoisomerases para o bom funcionamento da enzima; • Este processo ocorre até a RNA polimerase encontrar uma sequência específica no DNA que determina o término do alongamento.

27. TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO • Quando a RNA polimerase encontra o sítio de terminação na fita molde, ela se desliga do DNA juntamente com a nova cadeia de RNA sintetizada devido à uma desestabilização do complexo de transcrição; • O desligamento do RNA do sistema provoca a ruptura do complexo de transcrição e as fitas do DNA são renaturadas.

28. TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO • Em procariotos a região terminadora apresenta uma longa sequência de A na fita molde. A RNA polimerase , ao longo do pareamento AU (mais fraco) desestabiliza o híbrido DNA:RNA e o DNA é renaturado; • Em eucariotos, as 3 RNAs polimerases terminam a síntese em regiões de DNA ricas em T.

29. ATIVIDADES PÓS-TRANSCRICIONAIS • Em procariotos, logo após o RNA ser liberado da bolha de transcrição, os ribossomos se ligam e iniciam a tradução; • Em eucariotos, os RNAs sintetizados no núcleo durante o processo de transcrição são chamados de transcritos primários (hnRNA); • Na maioria das vezes, esses transcritos não representam a molécula madura, ou seja, aquela cuja sequência e estrutura correspondem à forma final do RNA funcional (mRNA); • Esses transcritos necessitam sofrer modificações que fazem parte do processamento do RNA.