1 / 37

BIOPROCESSING

BIOPROCESSING. „BIO-FELDOLGOZÁS”. Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése. Nyersanyag. Nyersanyag előkészítés. Fermentáció , biotranszformáció. term ék kinyerés, kiszerelés. Termék. Ipari biotechnológia kulcslépései.

Download Presentation

BIOPROCESSING

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”

  2. Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése Nyersanyag Nyersanyag előkészítés Fermentáció, biotranszformáció termék kinyerés, kiszerelés Termék Ipari biotechnológia kulcslépései • Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy transzformációra • Fermentáció,transzformá-ció: bioreaktorokban sejtszaporítás, antibiotikum, fehérje, stb. előállítás

  3. 1. Upstream - bioreaktorok - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás - aerob/anaerob fermentálás 2. Downstream - sejt izolálás - feltárás - extrakció - fehérje tisztítás - kiszerelés - melléktermékek, hulladék kezelés

  4. Fermentáció • A gyógyszer-, élelmiszer-, és vegyiparban használt (bio-) termékek előállításában a mikrobiális fermentációknak nagy jelentőségük van • Fermentáció hatékonysága sajnos gyakran elmarad a teoretikus maximumtól • Mikroba fiziológia • Rekombináns sejtekkel történő fermentációk • Mikrobiális konverziók – fermentáció • Enzimatikus folyamatokon alapuló konverzió – biokonverzió • Fermentor– reaktor, melyet mikrobiális konverziókra haszn.

  5. Fermentációs eljárások típusai Nyílt és zárt rendszerek • Szakaszos fermentáció (Batch) • a reaktánsokat (tápanyagok, sejtinokulum, gázok – folyamatos levegőztetés) együtt visszük a rdsz-be a fermentáció megkezdése előtt • alapvetően zárt rdsz • térfogat állandó • Egyszerű eljárás, de termékgátlás ill. szubsztrát gátlás lehetséges • Rátáplálásos szakaszos fermentáció (Fed-batch) • a tápanyagokat folyamatosan adagoljuk(szubsztrát gátlás elkerülése) • a térfogat nő, mert nincs elvezetés • Folytonos fermentáció (continuous) • nyitott rdsz • amennyi tápanyagot bejuttatunk, annyi térfogatnyit el is veszünk • paraméterek állandóak • Félfolytonos fermentáció (semicontinuous) • szakaszos fermentációk sorozata, melyben a fermentlé kb 10%-át a fermentorban hagyjuk, és ehhez adjuk a friss tápanyagokat

  6. bioreaktorok • Központi szerep, a bioreakciók helyszíne • Fontos a sejt kinetika, anyagtranszfer, folyadék keveredés a bioreaktor tervezéshez • Bioreaktor – hardware és software szabályozás, a mikroorg. számára fontos környezeti faktorok szinten tarthatók • Kultúra paraméterei: hőmérséklet, keverési sebesség, nyomás, gázáram, pH, pO2, esetleg pCO2, hígulás mértéke • Nagy felbontású (elsősorban laboratóriumi, az optimalizáláshoz) bioreaktorokba lehet on-line optikai denzitás mérés, szubsztrát konc. meghat.

  7. Bioreaktor konfigurációk • A bioreaktor (fermentor) egy edény, melyben a biológiai reakciókat kivitelezzük: • mikroorganizmus szaporítása, enzim- vagy immobilizált sejtes reakciók, szövettenyészetek • méret: 0,5-2 000 000 l • üveg-rozsdamentes acél, esetleg műanyag • Alapvető paraméterek nyomon-követhetők • Mintavételezési lehetőség • Kevertetés -nyíróerők

  8. Bioreaktor konfigurációk • Görgetett edény • Ált. műanyagból • Horizontális kialakítású, lassú keveréssel • Megfelelő levegőztetés, anyageloszlás érhető el • A sejtek a henger belső felszínéhez tapadva szaporodnak, nem lepi el folyamatosan a tápoldat • A töltet a henger térf. max 30%-a lehet • Olcsó, de a kontroll, és monitor nem hatékony Szabályozó egység Bioreaktor edény Görgető rendszer

  9. Bioreaktor konfigurációk • Kevertetett tank bioreaktorok • Leggyakrabban használt típus • Mechanikus keverő rdsz-rel ellátott • Rozsdamentes acél (kisebb térf-nál lehet üveg) • Magasság:átmérő arány (1:1, 3:1) • Keverés keverőlapátokkal, azok kialakítása a nyíróerők szempont-jából fontos • Levegőztetés megoldása • Sejtek denzitása ált. 106-107 sejt/ml, de ez javítható akár több nagyságrenddel is • Mérete akármeddig nem növelhető a keverés, oxigénellátás, hőmérséklet tartás miatt Kevert tankreaktor (angol: stirred tank bioreactor ‘STB’)

  10. távozógáz Gáz buborék Belső cső elem a gáz áramlás biztosítására áramlásmérő Gáz elosztó Gáz beinjektálása Bioreaktor konfigurációk • Air-lift bioreaktorok • Egyszerű, olcsó • A reaktor belsejében egy központi cső, un. emelő (riser), és egy külső hengeres gyűrű un. levezetőcső (downcomer) • Fertőzés veszély is csökken • Sejtek denzitása ált. 106 sejt/ml

  11. Bioreaktor konfigurációk • Fluid-ágyas bioreaktor • Hordozó, sejtaggretátok, kisebb térfogat (max 100 L) • nagy sejtmennyiséggel – szuszpendált és kitapadó sejtek is • Transzport folyamatok - nem elég hatékony • Fejlesztés kollagén mikrohordozóval jó eredmények • Reciklizáló cső • Sejtek denzitásaált. 108 sejt/ml

  12. Bioreaktor konfigurációk • Üreges szálas-bioreaktorok • Egyszerű, de max néhány liter • Kapilláris szálak egy henger testben, mindkét végén tapadnak • A sejtek a kapillárisok közötti térben szaporodnak (szövetszerű) • Főleg humán sejtkultúrák számára • Sejtek denzitása 108 sejt/ml • Termék visz. tisztán nyerhető

  13. Bioreaktor konfigurációk • Fix ágyas bioreaktorok • A sejtek hordozóhoz (pl. aktív szén) kötötten, vagy polimerbe csomagoltan • Fluid ágyassal szemben előny a stabilitás • Hátránya, hogy a transzport folyamatok mértéke kisebb, grádiens alakulhat ki a bioreaktorban(nem lesz homogén a rdsz) • Sejtek denzitása ált. 106-107 sejt/ml • Termék kinyerése nehézkesebb • Kerámia ágyas bioreaktorok • Kerámia hordozó, újrahasználható, költséghatékony • Jó minőség, hőmérséklet tolerancia • Széles körű felhasználás • Inhomogenitás lehet a reaktorban • Sejtek denzitása ált. 107-108 sejt/ml

  14. termék hőcserélő bioreaktor keverés • Mechanikus propellerek segítségével • Levegő áramoltatás segítségével • Külső hurok/ forgatás segítségével

  15. keverés • Feladata a megfelelő anyagtranszport fenntartása, azaz a beáramló levegő, a tápoldatban oldott (vagy nem oldott) tápanyagok, és a keletkező termékek egyenletes eloszlatása • Az egyes oldatok viszkozitása szintén befolyásolja a keverés módját, mértékét. Ez az időben változhat, egyrészt a szaporodó mikróbák, valamint a keletkező termék miatt. • A kevertetés mértéke akármeddig nem növelhető a nyíróerők miatt • A keverés sebességét és a levegőztetés sebességét egymást figyelembe véve kell optimalizálni (ne alakuljanak ki légüregek)

  16. Propeller fajták

  17. levegőztetés • Eltérő oxigénigény • aerob/anaerob szaporítás • baktériumok/gombák • enzimes/sejtes folyamatok • Oldott oxigén szint • oldhatóság mértéke hőmérséklet függő • Buborék méret • túl nagy buborék – hiábajuttatunk sok levegőt be, nem hasznosul • intenzív keveréssel lehet apró buborékokat nyerni • eleve apró buborékképzés - pezsegtetés külső belső

  18. oxigénellátás

  19. tápközeg Szilárd v. folyékony Természetes, félszintetikus, szintetikus Tápanyagok: • Szén-, energiaforrás • Nitrogénforrás, egyéb ásványi anyagok • Mikroelemek • Vitaminok • Növekedési faktorok

  20. Szén-, és energiaforrások Természetes: • melasz: a cukorgyártás mellékterméke. ~ 50% cukortartalom, de emellett jelentős nitrogénforrás is • sajt/tej permeátum: 6-7% szárazanyagtartalom, főleg laktóz, kevés zsír, fehérje, ásványianyagok • Magáztató folyadék (corn steep liquor-CSL): a magok nedves őrlése során keletkezik, cukrok és kismolekulasúlyú N tartalmú vegyületek • Manióka v. cassava: 20-40% keményítő, kevés fehérje, zsír • Bagasse: cukornádból a cukor kinyerése után visszamaradó rostos anyag

  21. Szén-, és energiaforrások Drágább, de természetes alapú alapanyagok: • húskivonat: fehérjéket, aminosavakat tartalmaz. Húsleves bepárlásával állítják elő. Lekvárszerű illetve por alakú • pepton: fehérjék savas vagy enzimatikus hidrolízisével állítják elő. Vízbenkönnyen oldódik. A fehérjék tripszines lebontásával (mely egészen azaminosavakig megy) keletkező magas triptofán tartalmú pepton a Trypton • Élesztőkivonat Pontos összetételük nem mindig ismert, változhat, ezért pl. laborban a kísérletek kivitelezése során inkább jól definiált alapanyagokat használunk

  22. Nitrogén források • Szervetlen: • nitrát sók, ammónium sók • Szerves • Kukoricalekvár: a kukoricaszem áztatása során keletkező áztatólé 50%-ra töményítve • Húskivonat • Pepton, tripton

  23. egyebek • Szervetlen ionok: • Foszfor, kén, vas, nyomelemek • Növekedési faktorok: • melyekre a mikróbáknak szükségük van szaporodásukhoz, de szintetizálni nem tudják • Szelektív ágensek: • Specifikusak az adott mikrobára, másokra gátló hatásúak • Habzás gátlók • csökkentik a felületi feszültséget (a folyadék-gáz határfelületen), ennek következtében a légbuborékok átmérője kisebb lesz • Szelektív körülmények • Pl. szén-, nitrogén forrás limitáció- elősegítheti bizonyos anyagok intenzívebb termelődését, extracelluláris termékek képzése • Van elég szénforrás, de kevés a nitrogén forrás poliszaharid, PHA felhalmozás (akkumuláció) lehet

  24. sterilezés (csíramentesítés) • Szennyező mikroorganizmusok elpusztítása a fermentáció előtt • Hőkezelés, sugárzás (UV, gamma), kémiai ágensek, ultrahang, szűrés • Hőkezelés gőzzel, ha nyomást is tudunk alkalmazni, jobb a hatékonyság, rövidebb idő elég (teszt organizmus Bacillus stearothermophilus) • Spórák elpusztítása érdekében néha többszörös sterilezés szükséges, ez azonban károsíthatja a tápanyagokat (pl. cukrok karamellizálódnak)

  25. sterilezés (csíramentesítés) • Tápoldat + gáz sterilezés • Folyadék • - szűrés/ülepítés • - kémiai-, hő- inaktiválás • 1. Szűréssel: • - cellulóz alapú filterek, pórus átmérő igény szerint változó 0,2 - 0,45 mm • 2. Inaktiválással: • - hőkezelés: teszt mikróba: Bacillus stearothermophilus • hőérzékenytápkomponensek • 3. Kémiai: hypo, formaldehid oxidálószerek (pl. H2O2, peroxiecetsav)

  26. sterilezés (csíramentesítés) Gáz - szűrés - UV, röntgen - kémiai Mi szennyez?: • penészgombák >> egyebek • fágok kiszűrése még ma sem megoldott Szűrés • filterek –hidrofób jelleg • formaldehiddel átitatott üveggyapot • kritikus sebesség/perc hatásfok igény: 0,5 - 1,5 térf. levegő/perc folyadék térfogatonként

  27. Fermentációs termékek • Sejt pl. élesztő, SCP • Elsődleges metabolitok pl. citromsav, etanol, glutaminsav (ált. 200 000 L kevertetett tank fermentorokban) • Másodlagos metabolitok pl. antibiotikumok (ált. 50 000 – 200 000 L térfogatban) • Enzimek (főleg extracelluláris, pl. amilázok, proteázok, lipázok. 30-220 m3 térf) • Terápiás fehérjék pl. interferon, növekedési hormon, inzulin… • Vakcinák pl. hepatitis-, szamárköhögés ellen

  28. termékkinyerés Centrifugálás, ülepítés, szűrés - sejtek összegyűjtése • Ha sejtalkotót, vagy intracelluláris terméket áll. elő szükséges a sejtek feltárása: • mechanikai: örlő malom, ultrahang, nyomás • kémiai: szerves oldószerek, detergensek • enzimatikus: lizozim (G+ baktériumokra, G- esetén SDS-sel együtt) • Extrakció, filtráció, adszorbció, kicsapás • Kis molekulák kinyerése pl. folyadék-folyadék extrakció • Oldószeres –hidrofób termék esetén • Detergens segítségével • Filtráció – szűrőn áteresztjük, dializis • Adszorbció - hordozóhoz kötjük a kinyerni kívánt anyagot • Kicsapás – csapadékot képzünk pl. magas sókonc-val (pl. ammónium-szulfátos) • Tisztítás • Kromatográfia (álló- és mozgó fázis) • Gélfiltráció • Elúciós kromatográfia (ioncserés, hidrofób, affinitás)

  29. Sejtek összegyűjtése, koncentrálása centrifugálással

  30. Sejtek feltárása ultrahang (1), detergens (2), nyomás (3), örlő malom (4) segítségével

  31. Kromatográfiás folyamatok • Kromatográfia elválasztási módszer. • Kromatográfiában az állófázis(mely ált. porózus, nagy felülettel rendelk. anyag) és a mozgófázis (ált. folyadék vagy gáz) között megoszlanak az anyagok egyensúlyi állandójuk szerint. • A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a befecskendezési ponttól a detektorig (érzékelő berendezés) jut. • Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később távoznak, mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. • Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

  32. Kromatográfia - gélfiltráció • Molekula méret szerinti elválasztás • Töltet: porózus szemcsék • Természetes polimerek (pl. dextrán, agaróz) • Szintetikus polimerek (pl. poliakrilamid)

  33. Kromatográfia - Hidrofób kromatográfia • Magas sókoncentráció mellett fehérjék képesek/hajlamosak poláros felszínhez kötődni • A sókonc. csökkentésével a fehérjék leválnak a hordozóról, eltérő sókonc-nál hidrofób tulajdonságuknak megfelelően

  34. Kromatográfia - Affinitás kromatográfia • Gélágy ligandja specifikus affinitással bír az elválasztandó anyaghoz • Az adszorbeált termék leválasztása pl. sókoncentráció, pH változtatás, vagy akár a ligandot az eluáló szerhez adjuk

  35. Kromatográfia - Ioncserés kromatográfia • Erős kationcserélő oszlop:a negatív töltésű állófázison pozitív ionokat választunk el. • Erős anioncserélő oszlop: pozitív töltésű állófázison negatív ionokat választunk el. • Ioncserélő kapacitás függ az állófázison kötött töltések számától. • A termék leválasztására ellenionokat tart-ó eluenst haszn.

  36. kiszerelés • Kristályosítás • A kristály - csak egyféle anyag alkothatja a kristályrácsot • Szárítás • ált. nagy felületen forró levegővel • Liofilizálás • hőérzékeny termékekre: vitaminok, enzimek, vakcinák, mikróbák, gyógyhatású fehérjék • Csomagolás • Hulladékkezelés

More Related