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原代细胞培养实验 --- 小鼠胚胎成纤维细胞培养

原代细胞培养实验 --- 小鼠胚胎成纤维细胞培养. 指导教师：费晓方. 2014 年 6 月. 实验目的和要求：. 掌握 无菌操作技术。 掌握 组织细胞的消化与分散。 熟悉 原代细胞培养的一般方法与步骤。 熟悉 小鼠解剖操作技术。. 动物的选择：. 选择大约一半足孕时间的胚胎， 10 － 13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎 2-5 个. 实验材料：. 每组的超净台中有以下物品：

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原代细胞培养实验 --- 小鼠胚胎成纤维细胞培养

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  1. 原代细胞培养实验---小鼠胚胎成纤维细胞培养 指导教师：费晓方 2014年6月

  2. 实验目的和要求： • 掌握无菌操作技术。 • 掌握组织细胞的消化与分散。 • 熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。 • 熟悉小鼠解剖操作技术。

  3. 动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎2-5个

  4. 实验材料： • 每组的超净台中有以下物品： • 1. 50ml 配制好的RPMI1640（或DMEM）培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)(生理型磷酸盐缓冲液)1 瓶 • 2. 100ml灭菌烧杯2个； • 3、50ml离心筒2个 • 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 • 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 • 5、细胞计数板1块； • 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； • 7、酒精灯1台；

  5. 试验操作步骤： 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) a．采用认可的方案处死啮齿动物。 b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。 c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS(-)的100ml烧杯中。 f．漂洗胚胎，去掉PBS(-)。继续用PBS(-)漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

  6. 试验操作步骤： 2)将2－5个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。 3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。 6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。

  7. 试验操作步骤： 7)离心混合的细胞悬液，1200r／rain，5分钟，弃上清。 8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。 9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。 10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。 11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。

  8. 试验操作步骤： 12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于 1.8ml 1％醋酸溶液中以裂解红细胞， 用血细胞计数器进行细胞计数。 13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织 培养液中，在饱和湿度的37°C C02培养箱中孵育直 至细胞铺满。 14)隔天进行细胞观察。

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