遗传学实验

1. 遗传学实验 S201 & S203 黎双飞 13926597017 667017 26535432 sfli@szu.edu.cn

2. 细胞遗传学实验（染色体实验5次）经典遗传学(果蝇为材料 4次）基础分子遗传学实验（DNA提取 2次）数量形状遗传学实验（1次）

3. 实验一 实验操作基本技能讲解和种子萌发 一 实验目的 1 了解实验室常规仪器使用和操作注意事项； 2 掌握常见植物种子萌发方法 ； 3 掌握种子有丝分裂根尖取材及处理过程。

4. 二 实验内容 （一） 实验室安全和注意事项； （二）熟悉显微镜、离心机和移液器的使用； （三）熟悉常用染料、缓冲液的配制； (四）实验报告格式 （五）种子萌发，处理根尖；

5. 双目观察筒，镜筒倾角为30°，瞳间距48-75mm 1 CX21显微镜

9. 显微镜的使用： 1. 将所需观察的标本放在载物台，上卡夹住。 2. 将标本移动到载物台中间，先用低倍物镜观察。 3. 将显微镜亮度调节钮调至最小，接通显微镜电源，打开显微镜电源开关。 4. 把亮度调节钮移至适当位置，转动粗调手轮将载物台，上升到能见到标本的影形，转动微调手轮即可得到清晰的物象。 5. 使用完毕转动粗调手轮将工作台下降到底，再将亮度调节钮移到最小亮度处。 6. 关闭电源开关。 注意事项： 1. 打开显微镜电源开关前一定要将亮度调节钮调至最小 2. 先用低倍物镜观察，再换高倍物镜，如果使用油镜观察，注意镜头的转动方向和使用后用清洁剂去除干净香柏油。 3. 转换物镜时，手握转换器，而不是物镜。

10. 离心机： • 操作程序： • 把离心机放置于平面桌或平面台上，检查离心机是否放置平稳。 • 打开门盖，将离心管平衡后放入转子体内，离心管必须对称放入。 • 关上门盖，检查门盖是否关紧。 • 插上电源插座，按下电源开关。 • 设置转速和时间：时间为倒计时，转速为由低到高且不能超过规定转速。 • 当转子停转后，打开门盖取出离心管。 • 关断电源开关，离心机断电。 • 注意事项： • 离心管必须平衡，且不能超过规定容量；如果是小体积的1.5 ml EP管，则必须是加入相同体积的液体； • 离心管必须对称放入； • 门盖一定要关紧； • 设置转速时要由低到高。

11. 电子电平使用注意事项 1 了解安装条件、安装步骤、电源条件; 2 熟悉具体使用 首先要清洁天平；接着平衡；然后称量；最后清洁、复原。 注意： 工作台水平干净；不能超出陈量范围；药品轻放、慢放；剧毒或腐蚀药品注意防护。

12. 移液枪的使用  移液枪的操作方法 • 设置移液体积：手柄的显示窗清楚地显示移液器所移液量。移液量通过顺时针或逆时针旋转操作按钮来设置。 • 装配吸头：在装配吸头前要保证移液嘴连件的清洁。将吸头紧紧按在移液器吸液嘴连件上，确保密封完好，其标志是在吸头与黑色吸液嘴连件形成清晰的密封圈。 • 吸液和放液：吸液时移液器保持竖直，吸头尖端没入液面下3毫米以下进行吸液。放液时吸头尖端可靠在容器内壁。慢吸慢放，始终用拇指控制按钮运动，以保证连贯一致。 • 丢弃吸头：移液后，用力向下按动推出器推出吸头，将吸头丢弃到废物缸中。 • 放置好移液器：移液枪用完之后要归到最大计量的位置，并放置在移液器架之上。

13. 移液枪的使用 注意事项： (1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 (2)为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。 (3)浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。 (4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g.

14. 移液枪的使用 (5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。(6)移液器未装吸头时，切莫移液。 (7)在设置量程时，请注意旋转到所需量程数字清清楚楚在显示窗中，所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。(8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）。 (9)严禁使用移液器吹打混匀液体。(10)不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。

15. (三） 常用染色液或稀释溶剂的配置 （每天来前10的同学免费提供纸质材料） 1） 常用固定液 纯酒精（或甲醇）可固定细胞质中的蛋白质，穿透组织的速度快，但易引起组织变硬和收缩。而醋酸（又名乙酸，由于在16.7℃以下的温度即凝固成冰状固体，故又名冰醋酸。）可固定染色质，又可使细胞膨胀，所以与酒精（或甲醇）混合使用时，它们的作用可以互补。 常用配方： 纯酒精（或甲醇） 3份 或 纯酒精（或甲醇） 2份 冰醋酸 1份 冰醋酸 1份

16. （三） 常用染色液或稀释溶剂的配置 1） 常用染液 1 铁醋酸洋红 45%的醋酸100毫升，加入1-2克洋红（carmine）煮沸，冷却后过滤。然后加入1-2%铁明矾水溶液5-10滴。或者可放入1个小铁钉，1分钟后取出。加入铁质有利于染色，但铁质过量，则会产生沉淀。此液可长期保存备用。常用于植物细胞染色，对花粉母细胞效果更佳。 2 苯酚（石炭酸）品红 苯酚品红（carbol fuchsin） 母液A 3克碱性品红，溶于100毫升70%酒精中（可长期保存）。 母液B 母液A10毫升，加入90毫升5%苯酚水溶液。 取45 毫升母液B，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%福尔马林溶液，即为苯酚品红染液。 改良苯酚品红 2-10毫升苯酚品红染液，加入98-90毫升45%冰醋酸和1-1.8山梨醇（山梨醇过量会出现结晶，影响制片的效果）。 此染液若放置两周，会提高染色效果。

17. 二 常用染色液或稀释溶剂的配置 （二） 常用染液 3 吉母萨（Giemsa）染液 0.5 g吉母萨，加几滴甘油进行研磨。研好后，加入33毫升甘油，放56-60℃条件下1.5-2小时，促使其溶化。再加入33毫升甲醇，热过滤，保存在棕色瓶中备用。此为原液。染色时，一般以PH=6.4-7.2的磷酸缓冲液按要求比例稀释使用。 4 0.1%秋水仙碱溶液 秋水仙碱0.1克（先用95％的酒精约5-10 ml助溶），蒸馏水100毫升，待完全溶解后将棕色瓶再用黑纸包装起来，4℃冰箱保存备用。

18. （三） 常用染色液或稀释溶剂的配置

19. (四) 实验报告格式 • 每次实验报告均要有封面; • 报告纸A4纸； • 实验目的 • 实验材料 • 实验简要步骤 • 实验结果 • 讨论分析

20. (五) 种子萌发和有丝分裂根尖准备 1 实验种子p 黄豆、蚕豆、红豆、绿豆 2 用具 培养皿，纱布，剪刀或刀片，冻存管 3 药品 秋水仙素， 冰醋酸、无水乙醇， 卡诺氏固定液（无水乙醇：冰醋酸＝3：1）

21. (五) 种子萌发和有丝分裂根尖准备 4 种子萌发过程 1）挑选适量黄豆种子放在已铺好纱布的培养皿中，加适量蒸馏水浸泡种子(水浸没种子的2/3)； 2）培养皿浸泡种子约（48-）120小时，观察种子萌发情况； 3）每天更换水，切0.5-1cm根尖用0.1%秋水仙素处理4h以上，然后用卡诺氏固定液固定24h，固定时间4-24小时； 4）根尖用70%乙醇保存（冻存管）。

22. 萌发过程 　种子从吸胀开始的一系列有序的生理过程和形态发生过程，大致可分 5个阶段： ①吸胀。为物理过程。种子浸于水中或落到潮湿的土壤中，其内的亲水性物质便吸引水分子，使种子体积迅速增大（有时可增大 1倍以上）。吸胀开始时吸水较快，以后逐渐减慢。吸胀的结果使种皮变软或破裂，种皮对气体等的通透性增加，萌发开始。②水合与酶的活化。这个阶段吸胀基本结束，种子细胞的细胞壁和原生质发生水合，原生质从凝胶状态转变为溶胶状态。各种酶开始活化，呼吸和代谢作用急剧增强。如大麦种子吸胀后，胚首先释放赤霉素并转移至糊粉层，在此诱导水解酶（如 α－淀粉酶、蛋白酶等）的合成。水解酶将胚乳中贮存的淀粉、蛋白质水解成可溶性物质(麦芽糖、葡萄糖、氨基酸等)，并陆续转运到胚轴供胚生长的需要，由此而启动了一系列复杂的幼苗形态发生过程。 ③细胞分裂和增大。这时吸水量又迅速增加，胚开始生长，种子内贮存的营养物质开始大量消耗。 ④胚突破种皮。胚生长后体积增大，突破种皮而外露。大多数种子先出胚根，接着长出胚芽。 ⑤长成幼苗。以后长出根、茎、叶，形成幼苗。有的种子的下胚轴不伸长，子叶留在土中，只由上胚轴和胚芽长出土面生成幼苗，这类幼苗称为子叶留土幼苗，如豌豆、蚕豆等。有些植物如棉花、油菜、瓜类、菜豆等的种子萌发时下胚轴伸长，把子叶顶出土面，形成子叶出土幼苗。

23. 　　种子萌发的外界条件 　种子萌发要求有适宜的水分、温度和氧供应。有些植物的种子萌发还受光照有无的调节。　　水 　休眠的种子含水量一般只占干重的10％左右。种子必须吸收足够的水分才能启动一系列酶的活动，开始萌发。不同种子萌发时吸水量不同。含蛋白质较多的种子如豆科的大豆、花生等吸水较多；而禾谷类种子如小麦、水稻等以含淀粉为主，吸水较少。一般种子吸水有一个临界值，在此以下不能萌发。例如大豆萌发时要求最低吸水量为风干重的120％，而小麦则为60％，水稻为35～40％。　　温度 　各类种子的萌发一般都有最低、最适和最高3个基点温度。温带植物种子萌发，要求的温度范围比热带的低。如温带起源植物小麦萌发的 3个基点温度分别为：0～5℃，25～31℃，31～37℃；而热带起源的植物水稻的 3基点则分别为10～13℃，25～35℃，38～40℃。还有许多植物种子在昼夜变动的温度下比在恒温条件下更易于萌发。例如小糠草种子在 21℃下萌发率为53％，在28℃下也只有72％，但在昼夜温度交替变动于28℃和21℃之间的情况下发芽率可达95％。种子萌发所要求的温度还常因其他环境条件（如水分）不同而有差异，幼根和幼芽生长的最适温度也不相同。

24. 　　种子萌发的外界条件: 氧 　种子吸水后呼吸作用增强，需氧量加大。一般作物种子要求其周围空气中含氧量在10％以上才能正常萌发。脂肪种子也叫含油种子，如大豆、花生等的种子萌发时需氧更多。空气含氧量在 5％以下时大多数种子不能萌发。土壤水分过多或土面板结使土壤空隙减少，通气不良，均会降低土壤空气的氧含量，影响种子萌发。　　光 　有少数植物如黄榕、烟草和莴苣的种子在无光条件下不能萌发。这类种子叫需光种子。有些植物如早熟禾、月见草属的Oenothera bienusis和毛蕊花等的种子在有光条件下萌发得好些。还有一些百合科植物和洋葱、番茄、曼陀罗的种子萌发则为光所抑制，这类种子称为嫌光种子。需光种子一般很小，贮藏物很少，只有在土面有光条件下萌发，才能保证幼苗很快出土行光合作用，不致因养料耗尽而死亡。嫌光种子则相反，因为不能在土表有光处萌发，避免了幼苗因表土水分不足而干死。此外还有些植物如莴苣的种子萌发有光周期现象（见光敏素）。 研究意义 　了解作物种子萌发所需的条件，掌握土壤湿度和播种深度，对于播种后早出苗、出全苗极为重要，是获得高产的第一步。有些作物如早稻的某些品种，种子没有休眠期，收获时如遇雨水和高温，就会在农田或打谷场上的植株上萌发，这种现象称为胎萌。种子在贮藏时如果湿而热也会萌发。有些杂草种子由于休眠期的个体差异，或在土层内分布深度不同，在若干年内陆续萌发，使防除困难。