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Amplificación de DNA in vitro : PCR (Polymerase Chain Reaction)

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Amplificación de DNA in vitro : PCR (Polymerase Chain Reaction). Laboratorio de Genética BIOL 3300L. Objetivos. Conocer: Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR Usos y aplicaciones del PCR Ventajas y desventajas del PCR Métodos de secuenciación de DNA.

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Presentation Transcript
amplificaci n de dna in vitro pcr polymerase chain reaction

Amplificación de DNA in vitro:PCR (Polymerase Chain Reaction)

Laboratorio de Genética

BIOL 3300L

objetivos
Objetivos

Conocer:

  • Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR
  • Usos y aplicaciones del PCR
  • Ventajas y desventajas del PCR
  • Métodos de secuenciación de DNA
pcr polymerase chain reaction
PCRPolymerase Chain Reaction
  • Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.
  • El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
  • Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.
polimerasa chain reaction reacci n en cadena de la polimerasa
Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa
  • Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.
  • Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.
  • Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
termociclador
Termociclador
  • La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador.
  • Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.
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El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:

  • 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

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2. Apareamiento o “anneling”:
  • Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.
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3.Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

reactivos necesarios para pcr
Reactivos necesarios para PCR:
  • Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
  • MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-
  • dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.

-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.

reactivos necesarios para pcr12
Reactivos necesarios para PCR:
  • Cebadores “primers”:Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M-
  • DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.

El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.

  • Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.
adyuvantes de la pcr
ADYUVANTES DE LA PCR
  • Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR.
  • Se usa DMSO,glicerol o BSA.
  • El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
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Polimerasa

  • En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta essensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.
  • Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol
an lisis de la muestra
Análisis de la Muestra
  • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.
  • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
an lisis de la muestra16
Análisis de la Muestra
  • La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad

Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

an lisis de la muestra17
Análisis de la Muestra
  • En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas
  • Hibridación, Southern Blot
aplicaciones
Aplicaciones

Se puede amplificar directamente de:

  • ADN genómico
  • cDNA (RT-PCR)
  • Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros
  • Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, análisis de fósiles
  • Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de “primers” con mutaciones)
  • Investigación forense
  • Pruebas de paternidad
aplicaciones19
Aplicaciones

Criminalística

  • Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.
  • Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)
ventajas del pcr
Ventajas del “PCR”
  • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.
  • El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.
  • Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
  • Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.
desventajas del pcr
Desventajas del “PCR”
  • Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.
  • Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
  • La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
  • Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)
materiales para pcr
Termociclador “Thermo cycler”

Microcentrífuga

Micropipetas de 2, 20 y 200 ul

Microtubos para “PCR”, estériles

Puntas estériles

Agua destilada, desionizada y estéril

ADN molde (ADN en estudio)

Primer Forward y Reverse

dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP de [25 μM] c/u)

10X buffer para PCR (Solución amortiguadora para “PCR”)

MgCl2 (25mM)

BSA

Polimerasa Taq

Materiales Para PCR
herencia del dna mitocondrial
Herencia del DNA mitocondrial
  • Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana (L). Primer Directo H34, primer reverso L15829
procedimiento para extracci n del dna gen mico previamente realizado
Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente realizado)
  • Se realizó un frotis bucal
  • El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%
  • Centrifugar por 5 minutos a 7K
  • Descarta sobrenadante
  • Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%
  • Incubar a 100˚C por 20 minutos
  • Centrifugar por 5 minutos a 7K
  • Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)
  • Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella

Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.

procedimiento para amplificar el dna pcr
Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)
  • Añada los siguientes reactivos en el orden indicado:

Mix 1

17.3

Mix 2

2.7

Total: 25 ul

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Condiciones para reacción en el termociclador:

1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.

32 ciclos: 94 °C por 30 segundos

54 °C por 1 minutos

72 °C por 70 segundos

1 ciclo: 72 °C por 10 minutos

  • Lleve a reaccionar en el termociclador.
secuenciaci n de dna
Secuenciación de DNA

Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger)

  • Polimerización interrumpida de ADN
  • Se lleva a cado polimerización de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.
  • Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel
geles de secuencia
Geles de secuencia

Secuencia automática

Secuencia Manual

direcciones de animaciones
Direcciones de animaciones
  • Dirección PCR

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

  • Dirección de secuenciación

http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf