DİLUSYON ve

1. DİLUSYON ve VÜCUT SIVILARINDA HÜCRE SAYIMI

2. Dilüsyonlar; • Konsantre solüsyondan, dilüe solüsyon hazırlamak için kullanılır. 1/10 luk dilüsyon demek; 1 kısım konsantre 9 kısım dilüent Ör; 1/5 kan dilüe edeceksek; 1 kısım kan 4 kısım SF

3. Olacak şekilde istenen hacimde serum veya diğer biyolojik sıvılar dilue edilebilir. • SORU; 1/5 dilusyon nasıl hazırlanır? 1 kısım serum 5 kısım total hacim Örneğin; Total hacim 250 mikrolitre olacak şekilde serumu 1/5 nasıl dilue edebiliriz? 1 kısım serum 5 kısım total X mikrolitre serum 250 mikrolitre total hacim Cevap: 50 mikrolitre serum alınır, üzerine 200 mikrolitre distile su ilave edilerek, 250 ml lik dilusyon elde edilmiş olur

4. Soru; 500 ml total hacimde, 1/4 dilusyon ile idrar hazırlandı, idrardan ne kadar alınmıştır? Cevap; 1 kısım idrar 4 kısım total X ml idrar 500 ml total 125 ml idrar alınır, üzerine 375 ml distile su eklenerek toplam 500 ml lik dilusyon elde edilmiş olur

5. Tüpte 15 ml NaCl çözeltisi ve 3 ml serum mevcut. • Soru; serum dilusyon oranı nedir? 3 ml serum 15 + 3 ml serum 3/18 1/6 Soru;1/ 6 olacak şekilde serumu çeşitli şekillerde dilue ediniz Örneğin; 10 mikrolitre serum alınır, 50 mikrolitre SF ile dilue edilir (total hacim 60 mikrolitre oldu (1/6) Ya da 20 mikrolitre serum alınır, 100 mikrolitre SF ilave edilir (total hacim 120 mikrolitre oldu 20/120 1/6)

6. VÜCUT SIVILARINDA HÜCRE SAYIMI Kan sayım cihazlarında aşırı uçta çıkan sonuçların periferik yayma ve neubauer lamı/thoma lamı ile yapılacak bir sayım ile teyit edilmesi hataları önlemek açısından önem taşımaktadır. Cihazda saydırılamayacak az miktarda sıvı,kan,idrar gibi örnekler de neubauer lamında sayılabilir. Hücre sayımı, gerektiğinde kan dışındaki vücut sıvılarında da yapılabilir (örn; BOS, çeşitli mayiler, idrar…)

7. HÜCRE SAYIMI • Neubauer lamı (hemositometresi) üzerinde iki sayım alanı bulunur. Bu iki sayım alanı bir çukurluk ile birbirlerinden ayrılmıştır. Her bir sayım alanında köşelerde dört tane 1 mm2'lik bölümler (büyük kareler) bulunur. Bunlar 16 tane orta büyüklükte kareye ayrılmıştır. (lökosit sayımı için) • Ortada bulunan büyük kare ise 25 tane orta büyüklükte kareye ayrılmıştır (eritrosit sayımı için). Thoma lamı Neubauer lamı

8. L L E L L Neubauer lamı

9. DİLÜSYON SIVILARI Eritrosit dilüsyon sıvısı olarak hayem sıvısı kullanılır. (5 gr. Sodyum Sülfat, 1gr. Sodyum Klorür, 0.5 gr. Civa Biklorür ve 200 ml distile su içinde hazırlanır). Bu sıvı, lökositleri ortamdan kaldırarak sadece eritrositlerin sayılmasını sağlar. Lökosit dilüsyon sıvısı olarak; 3ml Glasiyel Asetik Asit, 1ml Gentian Violet'in (%1'lik çözeltisi) ve 100ml distile su içindeki karışımı kullanılır. Bu eriyik de eritrositleri ortamdan kaldırır ve lökositlerin çekirdeklerini maviye boyayarak kolay görünmelerini sağlar. Fakat sulandırma için sadece SF de kullanılabilir.

10. L L E L L Eritrosit sayımı Kan 1: 200 veya 1:100 oranında dilusyon sıvısı ile dilue edilir. Neubauer lamı üzerine temiz bir lamel yerleştirilir. Karışımdan 10 mikrolitre alınıp, lamelin altından Neubauer lamına pipetlenir. Kan hızla, lamel ile Neubauer lamındaki çizgili alan arasına dolar. Hücrelerin yerleşmesi için 1-2 dk beklenir. Mikroskopta 100x büyütmede hücrelerin düzgün dağılıp dağılmadığı kontrol edilir ve Mikroskop, sayım için 400x büyütmeye ayarlanır. Eritrositler, Neubauer lamının ortasında bulunan 25 karede sayılır.

11. L L E L L Eritrosit sayımı Pipetleme sonrasında eritrositler, Neubauer lamının ortasındaki 1mm2 lik alandaki 25 karede sayılır (karelerin her birinin alanı 0,04mm2).. Eritrosit sayısı/mm3: 25 karede 50 tane saydığımızı farzedelim; Eritrosit sayısı X 10 (sabit sayı) = 50 X 10= 500 eritrosit/mm3 sonucunu buluruz. Eğer dilüsyon yaptıysak, en son çıkan sonucu dilüsyon faktörü ile çarparız. Yukardaki örnekte x5 dilüsyon yaptık diyelim, 500 bulduğumuz sonucu 5 ile çarparız, sonuç: 2500 RBC/mm3 olur.

12. L L E L L Örneğin çok berrak bir BOS geldi, homojen hale getirip (hafif ters düz edip) neubauer lamına pipetledik (dilüsyon yok). Orta 25 karede toplam 1 tane eritrosit gördük. Sonuç: 1 X 10 = 10 eritrosit/mm3’tür. Örneğin, kanlı bir BOS geldi, x200 dilüsyon yaptık. Neubauer lamına pipetledik. Ve orta 25 karede 40 eritrosit saydık. 40 x 10 (sabit sayı) = 400. Dilüsyon faktörü ile de çarparsak, 400 x 200 = 80000 eritrosit/mm3 sonucunu buluruz.

13. Eritrosit sayımı Bu karelerin 25’inin hepsinin sayılması yerine rastgele 5 tanesi de sayılıp 5 ile çarpılabilir. En mantıklı olan, köşelerdeki ve ortadaki alandır. 25’e göre hesap yapıldığı için, 5 ile çarpmak gerekir. Eritrosit sayısı/mm3: Örneğin, 5 küçük karede toplam 2 eritrosit gördük diyelim; 2x5= 10 eritrosit (25 karede) Sonuç: 10 x 10 = 100 eritrosit/mm3 Eğer dilüsyon yaptıysak, en son çıkan sonucu dilüsyon faktörü ile çarparız. Yukardaki örnekte x10 dilüsyon yaptık diyelim, 100 bulduğumuz sonucu 10 ile çarparız, sonuç: 1000 RBC/mm3 olur.

14. Sayılan eritrosit sayısı x dilusyon (200) = • 1: 200 dilusyonda, 5 kare eritrosit sayıldığında ; Sayılan karelerin alanı ( mm2) x derinlik (mm) 5 x 0,04 (mm2) 0,1 (mm) 10.000 x sayılan eritrosit sayısı / mm3 =

15. Örneğin bir tamkan geldi, tamkan cihazı bozuk ve eritrosit sayısı isteniyor; Hemoliz var mı diye kontrol ettik, hemoliz olmadığından emin olduktan sonra, x800 dilüsyon yaptık ve neubauer lamında sayım yaptık. (orta 25 karede) 600 eritrosit saydık. Hesap ???

16. Sizin bulduğunuz sonuç: Cihazdan çıkan sonuç: Örnek tamkan sayımı: Lökosit 13,32 bin/mm3 Eritrosit 4,8 milyon/mm3 Hemoglobin 11,2 g/dl Hematokrit 32.5 % Platelet 200 bin/mm3 Eritrosit normal değer: kadında 4,5.106 erkekte 5.106

17. L L E L L Lökosit sayımı • Genel teknik eritrosit sayımı ile aynıdır. Sadece sayım alanı farklıdır. • Kan, 1/20 oranında dilusyon sıvısı ile dilue edilir. • Neubauer lamı üzerine temiz bir lamel yerleştirilir. • Karışımdan 10 mikrolitre alınıp, lamelin altından Neubauer lamına pipetlenir. • Hücrelerin yerleşmesi için 1-2 dk beklenir. Mikroskopta 100x büyütmede hücrelerin düzgün dağılıp dağılmadığı kontrol edilir ve Mikroskop, sayım için 400x büyütmeye ayarlanır.

18. L L E L L Neubauer lamı

19. L L L L E E L L L L Dört büyük lökosit sayım alanından biri, hesap için gereklidir. Dört büyük alandan tercih edilen birisi sayılabilir. Diyelim ki, berrak bir BOS geldi, dilüsyona gerek kalmadan direk neubauer lamına pipetledik. Bir lökosit alanında 3 lökosit saydık. (Aynı sabit sayı olan 10 burada da geçerlidir). 3 x 10 = 30 lökosit/mm3 diye sonuç veririz. Örneğin, berrak BOS sayımı için, iki alan saydık diyelim. Toplam 5 lökosit saydık. Bir alan için 2,5 olur. 2,5 x 10 = 25 lökosit/mm3 sonucunu buluruz.

20. L L E L L Dört büyük kareyi sayıp 4’e bölmek daha sağlıklıdır. Çünkü hücreler homojen ya da orantılı dağılmamış olabilir. O yüzden 4 büyük alan sayılır. Dörde bölünür. Asıl sonuç budur. Ve sabit sayı 10 ile çarpılır. Örneğin, berrak bir mayi geldi. Dilüsyona gerek kalmadan mayiyi homojen hale getirip neubauer lamına pipetledik. 4 büyük alanda toplam 5 lökosit saydık. Bir alan için 5/4= 1,25 lökosit buluruz. 1,25 x 10 = 12,5 lökosit/mm3 sonucunu buluruz.

21. Toplam sayılan alan 4 mm2 dir. (4 büyük karenin toplam alanı) Lökosit sayısı / mm3; Sayılan lökosit x dilusyon = Sayılan alan ( mm2) x derinlik (mm) Köşelerdeki 4 büyük karenin sayıldığı düşünülürse; Sayılan lökosit x dilüsyon faktörü = 4 ( mm2) x 0.1 (mm)

22. Lökosit sayımı • Örneğin (x20 dilüsyonla) 4 büyük karede toplam hücre sayısı 8 olsun. Toplam lökosit sayısı nedir? • Cevap 1 Sayılan lökosit x 20 8 x 20 = = 400 lök/mm3 Sayılan alan ( mm2) x 0,1 (mm) 4 x 0,1 Cevap 2 4 büyük karede toplam 8 hücre vardır Bir karede ortalama 8/4= 2 hücre var demektir. 2x10 (sabit sayı)= 20 lökosit/mm3 20 x 20 (dilüsyon faktörü) = 400 lökosit/mm3

23. Örneğin, bulanık bir BOS geldi. X 50 dilüsyon yaptık ve neubauer lamında 4 büyük alanda toplam 130 lökosit saydık. Sonuç nedir?

24. 4 büyük alanda 130 lökosit saydıysak, 1 alan için 130/4 = 32,5 lökosit/mm3 buluruz. 32,5 lökosit x 10 (sbt) = 325 lokosit/mm3 Fakat bir de bu BOS’u sulandırdığımız için sulandırma faktörü ile çarparız. 325 x 50 = 16250 lökosit/mm3

25. 25 L 35 L 27 L 33 L Soru: Lökosit sayımı için mor tüp geldi, SF ile x20 dilüsyon yapıp neubauer lamında sayım yaptık. 4 büyük alanda 25, 35, 27, 33 lökosit saydık. Sonucu nasıl rapor ederiz?

26. Cevap: 25+35+27+33=120 Bir alan için 120/4= 30 lökosit/mm3 30 x 10 = 300 lökosit/mm3 300 x 20 (dil.f.) = 6000 lökosit/mm3 Örnek tamkan sayımı: Lökosit 6 bin/mm3 Eritrosit 4,16 milyon/mm3 Hemoglobin 11,2 g/dl Hematokrit 32.5 % Platelet 200 bin/mm3 lökosit normal değer: 4000-10000

27. Trombosit sayımı • Trombositler yabancı maddelere ve birbirlerine karşı yapışkanlıkları fazla olduğundan ve de çok küçük hücreler olduklarından sayılmaları zordur. • Genelde bu yöntemle sayılmazlar, kan sayım cihazları ile sayımları tercih edilir • Bu yöntemle kan 1:100 dilue edilir ve eritrositlerin sayma alanında sayım yapılır.