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U2BP

U2BP. 47. 47. 5’. 51. 3’. A. GCA. AAG. 52. 52. AAAAA. AAG. GCA. U1 or U7 Double. 47. 47. 3’. 5’. GCA. AAG. 51. 52. 52. AAAAA. AAG. GCA. pBabe puro. gag. puro. SV40. LTR. LTR. U1/U2 /U7. gag. puro. SV40. p. antis. LTR. LTR. CELLULAR SYSTEM.

antoinette
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Presentation Transcript


  1. U2BP 47 47 5’ 51 3’ A GCA AAG 52 52 AAAAA AAG GCA

  2. U1 or U7 Double 47 47 3’ 5’ GCA AAG 51 52 52 AAAAA AAG GCA

  3. pBabe puro gag puro SV40 LTR LTR U1/U2 /U7 gag puro SV40 p antis LTR LTR

  4. CELLULAR SYSTEM Immortalization with Large T Antigen Infection with retroviral vectors containing the different therapeutic RNAs Muscular biopsy from a D48-50 patient Puromycin selection Analysis of the expression of the transgene RT-PCR and western analysis

  5. In vivo expression of antisense RNAs M C U1-5’ 238 217 U1-5’ 201 190 180 160 3 ' 5 ' A A U U U U U C U C A U A C C U U C U G C U U G A U probe M C U2BP 307 U2BP ' 238 3 ' 5 217 201 190 A A A A A G A A G A A A A A G A A A A A U U A G A A A C 180 probe

  6. 47 47 47 51 51 51 Duch U1-5’ 52 52 52 53 U1-5’ U2BP Duch U7d M - + RT-PCR (single antisense) RT

  7. RT-PCR (double antisense) 47 47 47 RT Duchenne 51 51 5’BP 5’-3’ C dBP M 53 52 52 52 AAG GCA

  8. Western analysis 100 mg of total proteins Duchenne dyst 5’-3’ SMC 5’BP dBP -427 kDa -

  9. In mioblasti DMD si ha ripristino di sintesi di distrofina e del complesso del sarcoglicano

  10. Verso un approccio di terapia genica

  11. STOP STOP STOP STOP 22 23 24 22 24 22 22 23 Splicing 22 mRNA 23 24 24 23 24 AAAAA degradazione traduzione Modello animale del topo mdx pre-mRNA della distrofina 22 23 24

  12. Trasduzione in vivo di molecole antisenso:uso di vettori AAV U1/U7 promoter Antisense CMV promoter 5’-ITR GFP 3’-ITR Wpre SV40 misc intron BGH pA Il virus AAV ha un’alta efficienza di trasduzione nei muscoli e non è patogenico • Iniezione intramuscolo • Somministrazione sistemica • mediante iniezione nella vena caudale I muscoli iniettati vengono analizzati per: - analisi molecolare, (RT-PCR, Western) - immunoistochimica - saggi funzionali

  13. La distrofina localizza correttamente alla periferia delle fibre e l’espressione è mantenuta per diversi mesi Iniezione intramuscolo

  14. Anche il complesso distrofina-sarcoglicano è ripristinato

  15. Iniezione sistemica di AAV-U1 estensore tricipite Gluteo dorso Gastrocnemio tibiale quadricipite * diaframma *cuore

  16. Localizzazione di distrofina e complesso sarcoglicano

  17. Saggi funzionali - Creatin kinasi I topi iniettati hanno livelli serici più bassi di CK 15000 1000 5000 0 wt mdx U1 / b l 6 m d x U 7

  18. Saggi funzionali - Forza I topi iniettati mostrano recupero della forza muscolare 6 0 4 0 m 2 / N 2 0 k 0 wt mdx U1 U7 c 7 5 b / 6 l x d m U 7 U 1 wt mdx GFP+ GFP- singole fibre

  19. Saggi funzionali - Treadmill exhaustion test I topi iniettati mostrano aumento della resistenza allo sforzo Wt mdx AAV-U1

  20. Settembre 2006 - Stato dell’arte per una sperimentazione di terapia genica della DMD basata sull’approccio dell’exon skipping mediato da AAV-U1 Vettore AAV9 in sostituzione di AAV1 (tale vettore risulta avere un tropismo per il muscolo molto maggiore di AAV1 e in particolare per il muscolo cardiaco) Collaborazione con il gruppo del Prof. Barry Byrne (Florida) capo del National Gene Vector Laboratories (NGVL)per la produzione di virus ricombinanti di purezza GMP e per analisi tossicologica Registrazione di AAV9-U1 come farmaco orfano. Elaborazione di un CTD (Common Technical Document) da sottoporre all’ISS, e successivamente all’EMEA, per la richiesta di autorizzazione a sperimentazione clinica e registrazione del farmaco

  21. Stato dell’arte della sperimentazione clinica su DMD • PTC124 (PTC therapeutics) • Plasmide codificante distrofina full-length (Transgene e Mirus) • Intramuscolare (completato) • Intravena (comincia inizio 2007) • AAV1 codificante microdistrofina (AskBio) • Exon skipping con oligonucleotidi: • 2-O-metil fosforotioato contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007, Universita’ di Leiden e Prosensa) • Morfolino contro esone 51, (intramuscolo, cominciato; intravena pianificato per 2007; UK MDEX Consortium) • Fosforotioati contro esone 19, 1 soggetto (intravena, completato, Dr.Takeshima) • Exon skipping con U7 snRNA : • Fase di preparazione di un AAV2/1 (Danos - Genethon)

  22. Strategia generale perla costruzione di un vettore virale • I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis • sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione • La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali • si sfrutta questa segragazione per progettare vettori virali ricombinanti. • I geni virali e le sequenze che agiscono in cis sono separate su diverse molecole • i prodotti dei geni virali agiscono in trans • i geni virali possono essere forniti in un virus helper, in un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula “packaging” • le sequenze “cis “ sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula • produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione

  23. Ciclo vitale di un retrovirus • RNA genomico, 2 copie. • L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. • (Il DNA è anche convertito in forma circolare, che però non sembra essere un intermedio della replicazione). • Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. • L’apparato della cellula ospite trascive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. • 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

  24. Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus • Il genoma tipico contiene 3 “geni” • gene  regione codificante che dà origine a più di una proteina • I tre geni sono • gag (componenti del core nucleoproteico) • pol (replicazione e ricombinazione) • env (componente della membrana esterna) • Per l’espressione di pol deve essere ignorato un codone di stop • soppressione da parte di un glutamil-tRNA se la fase di lettura è la stessa di gag • slittamento del ribosoma se la fase di lettura è diversa da gag • L’efficienza del processo è del 5% • la quantità di gag prodotta è 20 volte superiore a quella di pol

  25. Vettori retrovirali U3 R U5 U3 R U5 1 Gag-Pol Env 2 3 3 Componenti separate U3 R U5 Gene terapeutico U3 R U5 1 p Gag-Pol 2 oppure p Env p VSV-G 3 3 Titoli di 107 unità trasducenti (t.u.)/ml Titoli di 1010 unità trasducenti (t.u.)/ml

  26. Vettori Retrovirali: situazione attuale e prospettive future • Pro • efficiente trasduzione ex vivo di cellule in attiva replicazione • linfociti e precursori delle linee ematopoietiche • notevole esperienza clinica ex vivo • efficace terapia genica di due bambini affetti da imunodeficienza • integra garantendo espressione prolungata, ma a basso livello • Contro • integrazione random • attivazione di oncogeni • shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione • capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb) • Sviluppi futuri: vettori lentivirali

  27. Vettori lentivirali • I lentivirus hanno un genoma più complesso • oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori. • Originariamente derivati da HIV-1 per trasdurre linfociti • “pseudotipizzazione” con VSV-G espande il trofismo • vettori “pseudotipizzati” con VSV-G possono essere somministrati direttamente in vivo • efficiente trasduzione di neuroni e cellule della glia del sistema nervoso centrale di roditori e primati • Vettori ibridi derivati da lentivirus non umani (SIV, FIV) • virus originale non infettivo per gli esseri umani • la reale efficacia in vivo deve essere ancora dimostrata

  28. Vettori lentivirali • Trasporto attivo del complesso di pre-integrazione attraverso i pori nucleari • possibilità di trasdurre anche cellule quiescenti • efficaci nel trasdurre cellule quiescenti ex vivo • trasduzione diretta in vivo potrebbe soffrire di alcune limitazioni • barriere tissutali nel caso della mucosa resporatoria • condizione intracellulare (necessità di replicazione) nel caso degli epatociti • devono ancora essere definiti il potenziale reale ed i limiti della trasduzione diretta in vivo mediata da vettori lentivirali • Limite comune a vettori retro- e lentivirali • la fase a RNA obbligatoria nel ciclo vitale impone determinati limiti nella cassetta di espressione, tra cui la mancanza di introni e di segnali di poliadenilazione.

  29. Virus Adeno Associati (AAV) • Parvovirus, inizialmente scoperti come contaminanti di preparazioni di Adeno, richiedono la presenza di un virus helper (per esempio, Adenovirus) per l’infezione produttiva • ad oggi sono stati caratterizzati 6 sierotipi • la maggior parte deli studi si è concentrata su AAV-2 • Ad oggi non sono stati associati a nessuna patologia • caratteristica ideale per derivare un vettore di terapia genica • Il genoma del virus naturale integra preferenzialmente in un sito specifico del genoma umano (AAVS1 nel cromosoma 19 q13.3-qter)

  30. Struttura genomica dei Virus Adeno Associati ITR (145 nt) ITR Rep Cap Integrazione Incapsidazione Rescue Replicazione del DNA Integrazione Rescue Proteine del capside: VP1, VP2, VP3

  31. Ciclo vitale dei Virus Adeno Associati Fase litica Fase di latenza Ad Rescue Ad Integrazione sito-specifica Replicazione

  32. Vettori AAV: struttura e produzione ITR (145 nt) ITR Promotore-Transgene (max 4.5 kb) • 1) Plasmide esprimente i geni rep e cap • 2) Adenovirus helper oppure • 2bis) Plasmide esprimente i geni di Adenovirus con funzione helper

  33. Vettori AAV:situazione attuale e prospettive future • Pro • efficiente trasduzione in vivo di cellule sia quiescenti che in attiva replicazione • espressione prolungata del transgene • descritte sia forme episomali che integrate • bassa immunogenicità • Contro • la massima capacità di impaccamento è 4,5 kb • con il sistema di produzione attuale si ottengono preparazioni a titolo relativamente basso e contaminate da virus • Sviluppi futuri: • miglioramento dei sistemi di produzione • aumento dell’efficienza di integrazione sito-specifica

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