Pneumocistosi

1. Corso di Perfezionamento NUOVI SVILUPPI NELLA DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA E VIROLOGICA(II edizione) 3° modulo: Micologia e Parassitologia 5-6 Novembre 2004 Pneumocistosi Prof. Guglielmo Gargani Dr. Gabriella Pini Dipartimento di Sanità Pubblica sez. Microbiologia Università degli Studi di Firenze

2. Pneumocystis carinii : La storia

3. Attuale posizione tassonomica • Phylum Ascomycota • Classe Archiascomycetes • Ordine Pneumocystidales • Famiglia Pneumocystudiaceae • Genere Pneumocystis • Specie Pn carinii (ratto) Pn jiroveci (uomo)

4. Ciclo vitale • Trofozoita ameboide negli alveoli con filopodi • Moltiplicazione per scissione binaria • Cellule aploidi che evolvono in sporoblasti • Sporoblasti o cisti producono all’interno 8 sporozoiti • Sporozoiti si liberano e ricomincia il ciclo

5. Ciclo Vitale

6. Mayor Surface Glicoprotein(MSG) • P.m. 95-160 kDa Nucleo centrale proteico Catene laterali carboidrati azotati glucosio mannosio n-acetil glicosamina Adesione agli pneumociti Determinanti Antigeni Special form

7. carinii rattus muris equi harictologi mustelae suis homini o Pn.jiroveci ratto ratto topo cavallo coniglio furetto maiale uomo “Special form”

8. Classi di eterogeneità • Fra special form da specie animali diverse • Fra special form della stessa specie animale • Fra ceppi della stessa specie animale

9. Pneumocystis organisms :

10. Pneumocistosi • A partire dal 1920 compare in bambini istituzionalizzati in Europa occidentale. • Dopo la II guerra mondiale è nei bambini denutriti in Europa orientale e M.O. • Dopo gli anni ‘50 in immunodepressi • Dopo il 1985 è causa frequente di morte in HIV positivi

11. Human Pneumocystis Infection • Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38

12. Forme clinico-epidemiologiche • Infezione asintomatica o non diagnosticata • Forma epidemica :dispnea progressiva, cianosi, perdita di peso diarrea.Febbre e tosse possono mancare • Forma sporadica in immunodepressi: prevalentemente polmonare altre localizzazioni possibili

13. Potential implication of Pneumocystis in SIDS • Pneumocystis cysts were detected in lungs from : • 31% of 134 cases of Sudden Infant Death Syndrome (SIDS) in Chile • 15% of 27 SIDS patients in Oxford (UK) • 3% of 342 infants deceased from other causes Vargas et al, Clin Infect Dis 1999

14. Polmonite da P. jiroveci Sintomatologia • Dispnea, tosse non produttiva • Cianosi, febbre • Reperti radiologici infiltrati polmonari Evololuzione più rapida in HIV positivi

15. Immagini radiologiche Infiltrati interstizio-alveoloari prevalentemte nei lobi inferiori Possibile reperto negativo fino a poche ore prima dell’exitus

16. Polmonite da P. jiroveci

17. Polmonite da P. jiroveci • Polmonite interstiziale plasmacellulare • Ispessimento spazi interalveolari • Alveoli ripieni di sostanza amorfa con ammassi di parassiti

18. Polmone in pneumocistosi Le frecce indicano zone confluenti grigio pallido

19. Cisti negli spazi alveolari

20. Pneumocistosi

21. Pneumocystis carinii

22. Corpi intracistici

23. P.jiroveci: cistial microscopio elettronico a trasmissione. Sono visibili corpi intracistici e una spessa parete

24. Altri fattori di rischio • Tutte le emopatie • Tumori solidi • Adenocarcinoma mammario • Tumori cerebrali • Immunosoppressione per trapianti

25. PneumocistosiDiagnostica di Laboratorio Tipologia di campioni clinici Sensibilità tecniche di colorazione >95% >90% 50-95% 50-85% Bassa Bassa Materiale • Biopsia aperta del polmone • Biopsia transbronchiale • Lavaggio broncoalveolare (BAL) • Sputo indotto (IS) • Risciacquo orale (OW) • Brushing orale

26. Bronchoalveolar lavage Induced sputum • More expensive, more invasive, risk of periprocedural sedation, requires skilled personnel • Larger samples can be sent for staining and can be used to diagnose other infections (bacterial, fungal, viral and mycobacterial cultures) • Saline instilled through bronchoscope wedged in airway and fluid withdrawn • To 95 percent sensitive • Nebulized saline inhaled by patient to promote deep cough • Inexpensive; noninvasive • Specimen processing more complex, may delay diagnosis of another pathogen • Less sensitive

27. Esame diretto • Colorazione metenamina-nitrato di argentoGomori- GroccotColora l’involucro della cisti in nero su fondo verde • Blu di toluidinaColora selettivamente l’involucro della cisti • Colorazione diGiemsao sua variante rapidaColora sia cisti che trofozoiti  nucleo porpora, citoplasma blu (non colora la parete cistica)

28. P.carinii: Con alto ingrandimento sono visibili le cisti di 5-8μm di diametro. L’involucro delle cisti è colorato in nero, i corpi intracistici non sono visibili. Biopsia aperta del polmone. Impregnazione argentica secondo Gomori (GMS)

30. P.carinii: sedimento di BAL colorato con metenamina-argento (GMS) che colora l’involucro cistico. Sono visibili cisti rotonde, ovali o piatte di circa 4-5 µm di diametro Tutti i fungi hanno la stessa affinità per metenamina-argento e possono essere confusi con le cisti di P.carinii. Cryptococcus neoformans in un campione di BAL (GMS).

31. Colorazione con blu di toluidina

32. Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa. I trofozoiti sono piccoli (1-5 µm) e solo i loro nuclei, colorati in porpora , sono visibili (frecce).

33. P.carinii: Sono visibili cisti (approx. 5-8 µm di diametro) con corpi intracistici, le cisti mature ne contengono 8. Alcune cisti appaiono vuote. Colorazione di Giemsa.

35. Campione di BAL, colorazione Fungi-Fluor Kit Polysciences Europe, Germany (400X) Fungi-Fluor non colora specificamente P. carinii (Colora chitina e cellulosa). Le cisti appaiono in clusters circondati da essudato schiumoso, il background di fondo interferisce con la chiarezza dell’immagine

36. cisti che mostrano le strutture caratteristiche a doppia parentesi o virgola

37. Esame diretto Immunoflurescenza con anticorpi monoclonali (contro ag di superficie, forma cistica e trofozoite) aumento sensibilità Kit commerciali MonoFluo kit pneumocystisBio-Rad laboratories MeriFluor pneumocystis kitMeridian Bioscience Europe Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA Chemicon USA

38. Immunoflurescenza direttacon anticorpi monoclonali MeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe

39. Immunoflurescenza direttacon anticorpi monoclonali Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA, Chemicon USA

40. Immunofluorescenza indiretta con ac monoclonali MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories

41. TRADITIONAL STAINS MONOCLONAL ANTIBODY STAINS • are less expensive • require less technical expertise and quipment • may allow the identification of other pathogens on the specimen • clearly differentiate the P. carinii organism • may be more sensitive, particularly in specimens with low numbers of organisms • false positives are a problem associated with using the monoclonal antibody stains.

42. Pneumocystis non si sviluppa in sistemi di coltura continua in vitro Esame colturale Non utilizzabile per la diagnosi di pneumocistosi Ricercadi anticorpi ELISA con ac policlonali su Siero Sensibilità 210ng ag (McNabb, 1988) Immunoblotting con ac monoclonali (2G2) su BAL Aumento della sensibilità (Sethi, 1990) Metodi non utilizzati a scopo diagnostico Ricerca di antigeni

43. Metodi biomolecolari Scopo: aumentare la resa diagnostica dei campioni clinici meno invasivi (sputo indotto, lavaggio orale….) • Gene targets • Single copy genes Ø      Dihydropteroate synthase (DHPS) Ø     Tymidylate synthase (TS) Ø      Internal trscribed spacer (ITS) Ø     5S rRNA Ø     18S rRNA Multicopy genes Ø Mitochondrial large subunit rRNA (mt LSU rRNA) Ø  Mitochondrial small subunit rRNA (mt sSU rRNA) Ø Major surface glycoprotein (MSG)

44. Lane S: Standard dei pesi molecolari • Lane 1: PCR a singolo step con primer pAZ102-E/pAZ102-H, banda di amplificato di 346bp (Wakefield, 1990) • Lane 2: nested PCR con ITS primer 1724F/ITS2R per il primo step ITS1F/ITS2R1 per il secondo step, banda di amplificato di 550bp. (Lu, 1995) • Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM. Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of rat and human origin. Mol Biochem Parasitol 1990;43:69-76. • Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR methods for detection of Pneumocystis carinii. J Clin Microbiol 1995;33:2785-2788.  

45. Metodi biomolecolari Significatività della ricerca del DNA nel BAL mediante PCR PCP clinicamente evidente Assenza di segni clinici evidenti HIV- HIV+ Non predittivo(17% positivi con nested PCR senza sviluppo della malattia, Sing 2000) Semplice colonizzazione o faseprecoce di malattia? Consigliato un attento monitoraggio Valore altamente predittivo

46. Sensibilità delle metodiche di ricerca del DNA con PCR su altri campioni clinici Metodi biomolecolari IS Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, >95% con mt LS rRNA primers) OW  Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, 56-78%. Fischer 2001, 91% con MSG primers) Bassa se la colonizzazione polmonare è scarsa (Matos, 2001) Siero Risultati contraddittori con sensibilità da 0 a 100%

47. Kit Commerciale per PCR • PNEUMO KIT(AB Analitica) • Kit completo per • Estrazione del DNA da BAL, altri campioni respiratori o tessuti fissati e inclusi in paraffina • Amplificazione (Gene target:rRNA 5S) • Elettroforesi su gel di agarosio: amplificato di 120pb • Controllo interno di amplificabilità (β-globina) • Controllo positivo

48. M-PCR KitMaxim Biotech San Francisco USA • Lane M: Standard dei pesi molecolari • Lane 1: Controllo negativo • Lane 2: controllo positivo • Lane 3: Clamydia pneumoniae • Lane 4: Mycoplasma pneumoniae • Lane 5: Pneumocystis carinii • Lane 6: Legionella pneumophyla Multiplex-PCR

49. Quantitative Touch-Down Real Time PCR MSG primers Sonde FRET • Campioni OW cut-off a 50 copie DNA per tubo distingue fra infezione e colonizzazione (Larsen 2004) Campioni BAL cut-off a 103 copie DNA per tubo distingue portatori da pazienti con PCP (Flori 2004)

50. Metodi biomolecolari • Vantaggi • Aumento della sensibilità • Elevata specificità • Utile per i pazienti che non possono sopportare procedure invasive • Svantaggi • Stadio sperimentale • Mancanza di metodi standard riconosciutia livello internazionale • Possibili risultati positivi di difficile interpretazione