人类外周血染色体标本 制备与观

1. 人类外周血染色体标本制备与观

2. 实验目的 • 1、学习外周血淋巴细胞悬浮细胞培养的原理和方法，利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本 • 2、了解人类染色体的基本形态特点，为核型分析和原位杂交实验提供良好的染色体标本

3. 实验原理 • 外周血中的淋巴细胞几乎都处于G0期或G1期，一般情况不分裂。当收到植物血凝素（PHA）刺激时，这种小淋巴细胞会转化成淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素、低渗、固定、滴片和染色处理，就可获得大量中期分裂相细胞，进行染色体形态、数目等观察。

4. 实验主要仪器和试剂 • 1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。 • 2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。

5. 主要方法步骤 • 1. 采血及接种培养 • 1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。 • 1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。 • 1.3 在超净工作台中，预先将RPMI 1640液体培养基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴全血（6号针头），水平摇动混匀。 • 1.4 置37℃恒温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养物1～2次，使血液均匀悬浮，再继续培养。 • 1.5 终止培养前2～4小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2μg/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。

6. 2．制片 • 2.1 收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物，再将全部培养物吸入刻度离心管中。 • 2.2 1000 rpm离心8分钟（注意先配平）。 • 2.3 弃上清液，加入37℃预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理25分钟。 • 2.4 加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混匀，1000rpm离心8分钟。 • 2.5 弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。 • 2.6 1000 rpm离心 8分钟。 • 2.7 弃上清液，重复固定一次。 • 2.8 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。 • 2.9 吸取少量细胞悬液，滴2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。 • 2.10 将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干。 • 2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。

7. 实验结果

8. 注意事项 1、培养温度应严格控制在37±0.5℃，培养液最适合pH为7.2-7.4 2、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。 3、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。 4、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。 5、固定液应在使用前临时配制。 6、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。