3 蛋白质研究技术

1. 3 蛋白质研究技术 ▲蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。 ▲目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:⑴材料的选择； ⑵组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；⑶蛋白质初步提纯；⑷选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；⑸目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。

2. 一、蛋白质是两性电解质 根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。 作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI) ，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。 所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。 1. 蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。

3. 主要内容 3.1 透析 3.2 层析原理 3.3 凝胶过滤 3.4 离子交换层析 3.5 亲和层析 3.6 电泳 3.7 蛋白质氨基酸序列确定 3.8 肽的化学合成

4. 1.1 透 析 按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。 透析袋 浓缩的蛋白混合样品 透析液 开始透析 处于平衡状态

5. 1.2 层析原理 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。

6. 将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。将作为固相成分的不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 • 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 • 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。

7. 1.2 凝胶过滤层析 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。

8. 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 凝胶过滤层析过程示意图

9. 凝胶基质 凝胶珠 小分子 大分子 凝胶过滤层析过程示意图

10. 1. 3 离子交换层析 如果被分离的样品中各个成分受溶液pH的影响，有时带正电荷，有时带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。 离子交换层析的固相是离子交换体，包括离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。 带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式出现的叫做阳离子交换基； 带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴离子交换基。

11. 阳离子交换基 强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂

12. 阴离子交换基 强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素

13. 时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH值。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；而当pI > pH时，蛋白质带净正电荷。 举一例子： 已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。 答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。

14. 平衡液洗 加样 阳离子交换层析过程 蛋白质 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 离子交换树脂 收集

15. 1.4 亲和层析 依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。 当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。

16. 平衡液 含配体溶液 混合蛋白样品 带有配体的树脂珠（或胶粒） 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白

17. 亲和层析过程

18. 1.5 蛋白质的胶体性质与盐析分离 蛋白质在水中可形成一种稳定的亲水胶体。 细胞原生质的主要成分是蛋白质，原生质的胶体状态主要是由蛋白质的胶体性质所造成的。 盐溶现象：在盐溶液很稀的范围内，随着盐浓度的增加，球状蛋白质的溶解度也随之增加（图例），此现象称作盐溶(salting-in) 。任何物质的溶解度都取决于溶质分子间的相对亲和力及溶质分子与溶剂分子的相对亲和力。任何降低溶质分子相互作用的因素以及加强溶质分子与溶剂分子相互作用的因素都有助于增加溶解度。 盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小，彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析(satting-out) 。 离子强度(μ) ＝ΣCZn21/2

19. 图例

20. 练习题 1.某种蛋白质当用凝胶过滤法测定其分子量为90kD，而用SDS-PAGE测定其分子量为60kD，无论是否有巯基乙醇存在都如此。为什么会有二种不同的结果？你认为哪种方法更准确？ 2. 从下面的信息确定某一蛋白质亚基组成： 1). 用凝胶过滤法，测定其分子量为200kD， 2). 用SDS-PAGE，测定其分子量为100kD， 3). 在巯基乙醇存在下，用SDS-PAGE分析，获得的分子量 为60kD和40kD. 3. 1). 是Trp还是Gln更有可能出现在蛋白质的表面？ 2). 是Ser还是Val更少可能出现在蛋白质的内部？ 3). 是Leu还是Ile更少可能在α-Lelix的中间部位找到？ 4). 是Cys还是Ser更有可能出现在β-Sheet中？ 4.在生理条件下，多聚赖氨酸呈随机卷曲的构象，在什么样 的条件下，它可以形成α-helix？