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iGEM Chiba 2009. E. Coli Time Manager Since 2008. iGEM CHBA 2009 の目標. 昨年度作成した時間差スイッチ. ・ 別々の入力であるため、  同一系内での時間の流れを表現することができない。 ・1通りの時間差しか生み出せていない。 ・蛍光強度の上昇し始めに差が見られない。. 09 CHIBA は流れと精確性のある時間差スイッチをつくる!. 時間の流れをつくるには. 並列型. 直列型. 並列型作成案. 直列型作成案. デモンストレーション向け実験. 並列型案①: LuxR Mutant.

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Presentation Transcript
igem chiba 2009

iGEM Chiba 2009

E. Coli Time Manager

Since 2008

igem chba 2009
iGEM CHBA 2009 の目標

昨年度作成した時間差スイッチ

・別々の入力であるため、

 同一系内での時間の流れを表現することができない。

・1通りの時間差しか生み出せていない。

・蛍光強度の上昇し始めに差が見られない。

09CHIBAは流れと精確性のある時間差スイッチをつくる!

luxr mutant
並列型案①:LuxR Mutant

寺久保先輩が作成しているLuxRMutantをお借りして、並列回路を作ろうと考えています。

Rapid

GFP

Plux

Wild type LuxR

Dyll luxR

Sensitive luxR

Normal

AHL

Plux

GFP

Delay

Plux

GFP

luxR

luxR

luxR

luxR

luxR

luxR

luxr mutant mutant
並列型案①:LuxR mutantMutant 選別実験

現状:約10000個(種類)のMutantプラスミド懸濁液

1, プラスミド混濁液を、元々pLux-GFPが入った株でtransformationする。

2, 各コロニーを96deepwellで液倍し、1sampleあたり、

4種類のAHL濃度(0, 1, 10, 100nM)×3=12wellを使って培養。

30分毎に、蛍光強度を計測。

この時、Wild typeのLuxRもN.C.として培養&計測する。

Q1、いくつSampleを扱えばいいのか?

Q2、何分ごとに蛍光強度を測定するのがベストなのか?

Q3、濃度の段階はどの間隔がベストなのか?

luxr mutant mutant parts
並列型案①:LuxR mutantMutant parts 作成実験

Wild type よりも30分以上蛍光強度上昇の様子が早まったor遅れたモノだけ

PCRでbiobrick仕様の制限酵素サイトをつけ、p15Aのプラスミドにのせる。

P15A

LuxR mutant

Q、ポジティブフィードバックは使えないのではないか。

slide10
並列型案②:細胞内カスケード

pLac

LuxI

pTet

pLux

pLac

LuxR

LacⅠ

CⅠ

pλCⅠ

GFP

slide11
直列型案:細胞外カスケード

最終的に並列回路と同時に起動させたいので

最初のスイッチは

LuxI(OHHL)で統一

pLac-LuxR

pTet-LuxR

pLux-GFP-???

pTet-???

p???-GFP

LuxI(OHHL)とクロストークしない組み合わせで

細胞外カスケードを作り、時間差を生み出す。

slide12
直列型案:細胞外カスケードクロストークしない組み合わせ直列型案:細胞外カスケードクロストークしない組み合わせ

LuxI protein family syntheses

from Staphylococcus aureus

AIP receptor and activator of P2 promorter

agrA agrC

agrB agrD

From 07Cambridge

slide13
直列型案:細胞外カスケードシステム構成案 Las型/ペプチド型

弐号機

初号機

零号機

pTet-LuxR

pLux-LasI-Reporter

pTet-LasR

pLas-Reporter

pLac-LuxI

pTet-LuxR-AgrB

pLux-AgrD

pTet-AgrA-AgrD

pLas-Reporter

lux las
直列型案:細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験

零号機 : LuxI(Sender)

BBa_K084012

を使用。

plac LuxI

初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender)

作成が必要。

ptet LuxR plux GFP LuxI LasI

初号機 : pLuxの漏れ対策版

作成が必要。

ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI

弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter

作成が必要。

ptet LasR plas GFP LasI

lux las luxr lasi
直列型案:細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験① LuxR-LasI

初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + LasI(Sender)

ptet LuxR plux GFP LuxI LasI

T9002

ptet LuxR plux GFP

C0061

LuxI

C0178

LasI

1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。(Reverseプライマーデザイン必要)

2, C0061(LuxI)をつなげる。

3, ポジティブフィードバックの効果測定

4, C00178を作成して完成

lux las1
直列型案:細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験①ポジティブフィードバック効果調査

T9002

ptet LuxR plux GFP

作成したパーツ

ptet LuxR plux GFP LuxI

①誤作動の有無の確認

AHLを加えない状態で培養し、GFPの漏れの有無を調べる。

  誤作動が見られた場合→ plux/lacO 版を作成 or Las型パーツ作成中止

②効果の有無の確認

T9002(元のパーツ)との蛍光強度の上がり方を比較する。

lux las plax laco
直列型案:細胞外カスケード Lux-Las型 パーツ作成実験① 漏れ対策pLax/lacO

初号機 : pLuxの漏れ対策版

ptet LuxR LacI plux/lacO GFP LuxI LasI

C0061

LuxI

C0178

LasI

S03600

pTet LuxR

C0012

LacI

K091100

plux/lacO

E5501

RBS+GFP

3とおりのパーツ作成方法

1, 3ステップでつなげる

2, 部分的に合成する。

3, 前合成する。

lux las2
直列型案:細胞外カスケード Lux-Las型パーツ作成実験②

弐号機 : LasR(Receiver) + Reporter

ptet LasR plas GFP LasI

R0040

pTet

K091118

LasR plas GFP

C00178

LasI

1, K091118からPCRで下流のターミネーターを取り除く。

  (Reverseプライマーデザイン必要)

2, R0040をつなげる。

3, さらにC00178をつなげて完成。

slide20
見せるための実験①:AHL拡散の様子@固体培地見せるための実験①:AHL拡散の様子@固体培地

・LuxI:OHHLのチェック

BBa_T9002を導入した大腸菌を撒いた固体培地にOHHLを滴下し、 各コロニーの蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する

・LasI:OdDHLのチェック

BBa_K091134を大腸菌に導入し、

IPTGを入れた固形培地に撒いてOdDHLを滴下して各コロニーの

蛍光強度が一定に達するまでの時間を測定する

slide21
見せるための実験②:複数のレポーターの準備見せるための実験②:複数のレポーターの準備

初号機のGFP部分の色違いのパーツです。

赤色:BBa_I731012

Ptet LuxR plux RFP

黄色:BBa_K084003

Ptet LuxR plux YFP

これらに初号機(BBa_T9002)と同様にLuxI:BBa_C0061、LasI:BBa_C0178をつけることによって蛍光色のバリエーションを作ろうと思っています。

slide22
直列型案:細胞外カスケード ペプチド型パーツ作成実験

零号機 : LuxI(Sender)

BBa_K084012

を使用。

plac LuxI

初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender

ptet LuxR plux GFP AIP Sender

作成が必要。

弐号機 : AIP Detector(Receiver) + Reporter

AIP Detector + Reporter

I746220

作成不要

作成が必要。

slide23
直列型案:細胞外カスケード ペプチド型パーツ作成実験

初号機 :LuxR(Receiver ) + Reporter + AIPSender

ptet LuxR plux GFP AIP Sender

T9002

ptet LuxR plux GFP

I746009

AIP Sender

1, T9002からPCRでターミネーターを取り除く。(Reverseプライマーデザイン必要)

2, I746009つけてかんりょう