ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית

1. ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית

2. מבנה הקורס: בכל שבוע תינתנה 2 שעות פרונטליות ולאחריהן שעת תרגול שמטרתה להעמיק את הידע הנדרש בשיטות מולקולריות נפוצות. דרישות הקורס: הגשת 3 מטלות במהלך הסמסטר, מעבדה בהנדסה גנטית (מפגש אחד)- השתתפות והגשת דוח מעבדהחובה, מבחן סוף סמסטר המבוסס על חומר קריאה והרצאות. מבנה הציון: מטלות במהלך הסמסטר – חובת הגשה בלבד מבחן סוף סמסטר – 100% ציון azeb@bgu.ac.il ramonb@bgu.ac.il

3. http://bioweb.wku.edu/courses/Biol22000 • http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/ClipArt-molecules.html • http://genetics.nbii.gov/basic2.html • http://ory.ph.biu.ac.il/~snunit/library/mulg.shtml בעברית • אתרי אנימציה • http://www.dnalc.org/shockwave • http://academy.d20.co.edu/kadets/lundberg/animations.html • http://vcell.ndsu.nodak.edu/~christjo/vcell/animationSite/transcription/movie.

4. שיעור 1 - תוכנית • מבוא : • מהי ביולוגיה מולקולרית ובמה היא עוסקת • מהי הנדסה גנטית • מהם השימושיים המעשיים בשיטות אלו • הכרת מושגי יסוד : • מבנה ואירגון ה-DNA :. • מבנה הכרומטין, נוקלאוזומים והיסטונים. • בסיסי ה-DNA וכיווניות הגדילים.

5. שיעור 1 - תוכנית • הכפלת ה- DNA • תהליך ההכפלה הסמי-קונסרבטיבי של ה-DNA, • הגדיל המוביל והגדיל הנסוג. • האנזימים המעורבים בתהליך ההכפלה

6. הגדרה – ביולוגיה מולקולרית • ביולוגיה מולקולרית עוסקת בעיקר באינטראקציה בין מערכות שונות של התא, כולל הקשרים בין הדנ"א, הרנ"א והסינתזה של החלבונים, והבנה כיצד קשרים אלה מבוקרים • שכפול, שעתוק ותרגום של החומר התורשתי .

7. הגדרה – ביואינפורמטיקה • ביואינפורמטיקה והביולוגיה החישובית • סידור המידע השאוב מניסויים ביולוגים. • מיישמת כלים מתחום מדעי המחשב, המתמטיקה, הסטטיסטיקה תורת המידע לשם עיבוד מידע ביולוגי רחב היקף. • כלים אלה כוללים מודלים מתמטיים, אלגוריתמים ותוכניות מחשב, שמתאפיינים בהתמודדות עם מאגרי מידע גדולים, בעיות בסיבוכיות גבוהה, וחיפוש אחר תבניות.

8. הגדרה – הנדסה גנטית • העובדה העומדת בבסיס ההנדסה הגנטית היא: קיום האפשרות להעביר גנים מאורגניזם אחד למשנהו וע"י כך לשנות את התנהגותו של האורגניזם "המושתל." • תהליך של שינוי גנים של יצורים חיים, ובכך שינוי תכונותיהם • רק בשנות ה-70 של המאה העשרים פותחו שיטות שאפשרו לבצע הנדסה גנטית.

9. לשם מה הנדסה גנטית? • ביוטכנולוגיה – שיפור תהליכי ייצור (ייצור מסחרי של חלבונים נדירים לרוב תרופות – אינסולין ).

10. לשם מה הנדסה גנטית? • השבחת גידולים חקלאיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם.

11. לשם מה הנדסה גנטית? • השבחת בעלי חיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם.

12. לשם מה הנדסה גנטית? • שינוי מיקרואורגניזמים

13. לשם מה הנדסה גנטית? • ריפוי גני (תיקון גנים פגועים במחלות בבני אדם).

14. יישום • גן מחיידקים המוחדר לצמחים עלמנת לייצר קוטל חרקים "טבעי". • גן לאינסולין הומני מוחדר לצמחים לשם ייצור המוני. • כותנה כחולה לייצור מכנסים בלי ‏צורך בצביעת הבד • תותים שהחדירו לתוכם גן מתוך דג הסנדל, מגן מפני טמפרטורות קרות. • פיתוח זני פרחים בעלי צבעים ודוגמאות ייחודיות • עזים שמייצרות חלב שמכיל אנזים אנושי, חיוני להצלת חיי אדם

15. מזון/צמחי Genetic Engineering Modified (GEM) • בארץ נעשים ניסויים רבים בהנדסה גנטית ‏בצמחים, לא מגדלים אותם מסחרית. • השוק הארופי אוסר על הכנסת זנים GEM

16. האורז המוזהב • החדרת גן באורז היוצר פרו-ויטמין ‏A‏ ‏‏(בטא-קרוטין) - וויטמין חיוני להתפתחות וגדילה ולבניית ‏פיגמנט הראייה. • את הפטנט על "האורז המוזהב" מציעים ‏המדענים חינם לממשלות דרום-מזרח אסיה, השוק הגדול ‏בעולם של אורז. 2.5 מיליארד בני אדם שמזונם הבסיסי הזה (אורז לבן בעיקר) חסר בטה-קרוטן ‏ומסיבה זאת ראייתם של מיליוני ילדים בעייתית, עד כדי ‏סכנת עיוורון. "האורז המוזהב" יכול להצילם

17. מבנה התא גרעין מיטוכונדריה ממברנה ציטופלזמה

18. הדנ"א נושא את המידע התורשתי ביצורים אאוקריוטיים רוב הדנ"א נמצא בגרעין התא.

19. הכרת מושגי יסוד : מבנה ה-DNA • כרומטין - ה-DNA יחד עם החלבונים הנלווים אליו (הנקראים היסטונים). • בנוסף להיסטונים, קשורים אל ה-DNA חלבונים אחרים (חלקם אנזימים) בעלי תפקידים מגוונים.

20. הליפוף המיוחד של מולקולת ה-DNA סביב החלבונים מסביר את אריזתה הצפופה בצורה יוצאת מגדר הרגיל: אם נמתח מולקולת DNA המרכיבה כרומוזום אחד, אורכה יהיה כ-30 ס"מ, גודלו של הכרומוזום, לעומת זאת, קטן ממיקרומטר (מיליונית המטר).

21. חלבונים היסטונים: • חלבונים קטנים ובסיסיים מאוד. כתוצאה מהטעינה החיוביות הם מסוגלים לקשור באפיניות גבוהה את הDNA הטעון שלילית. • ההיסטונים מאוד שמורים באבולוציה של אאוקריוטים, מה שמעיד על העובדה שיש להם פונקציה שהשתמרה לאורך האבולוציה. לפיכך מוטציות בגנים שמקודדים להיסטונים הן קטלניות. • היסטונים מופיעים בכמות אדירה בתא (60 מליון בתא) (לצורך הייחוס חלבוני רפליקציה מופיעות במספר בודד, DNA פולימראז מופיע בערך 10,000 בכל תא)

22. נוקלאוזומים– החרוזים , וזו היחידה הבסיסית ביותר במבנה הכרומטין. מורכב מליבה היסטונית ומסיב DNA.

23. בשלב האינטרפאזה נמצא הכרומטין בתא באופן מפוזר. בעת חלוקת התא (מיטוזה או המיוזה) הכרומטין עובר כמה שלבי אריזה: • כל שלב דוחס את הכרומטין עד לכדי רמת דחיסה של פי 20,000-100,000. • הכרומטין קיים בשתי צורות: • אאוכרומטין: יחסית אינו צפוף; הגנים שארוזים בו יכולים, לפיכך, לעבור שעתוק, • הטרוכרומטין: מצופף מאוד; הגנים הארוזים בו בדרך כלל אינם מבוטאים.

25. DNA- Deoxyribose Nucleic Acid • אבני הבניין של הדנ"א. • המבנה המרחבי של הדנ"א. • אריזת הדנ"א. • הכפלת הדנ"א.

26. ה-DNA נושא את המידע התורשתי • ביצורים אאוקריוטיים רוב ה-DNA נמצא בגרעין התא. • ה-DNA הוא פולימר אשר היחידה הבסיסית היא נוקלאוטיד. • ה-DNA מורכב משני גדילים הקשורים בקשרי מימן.

27. הנוקלאוטיד בנוי משלושה רכיבים: בסיס חנקני סוכר בעל 5 פחמנים (דאוקסיריבוז) זרחה. אבני הבניין של מולקולת הדנ"א

28. במולקולת הדנ"א יש 4 סוגים של נוקלאוטידים. הם שונים זה מזה בבסיס החנקני. מסמנים כל בסיס באות הראשונה של שמו ACGT

29. סליל ה- DNA • אלפי נוקלאוטידים מתחברים בניהם ויוצרים שרשרת ארוכה. • שרשרת של נוקלאוטידים יוצרים גדיל אחד של מולקולת הדנ"א. • הנוקלאוטידים קשורים זה לזה בקשרים קוולנטים. הקשר נוצר בין הסוכר של נוקלאוטיד אחד לזרחה של הנוקלאוטיד הסמוך.

30. הפוספט של נוקלאוטיד אחד נקשר לסוכר של הנוקלאוטיד הסמוך בפחמן '3. כתוצאה מתקבל גדיל שבקצהו האחד יש נוקלאוטיד בו מצוי פחמן '3, והוא חופשי לקלוט עוד נוקלאוטיד. קצה זה נקרא קצה '3. בקצה השני של הגדיל נמצא הפוספט, המחובר לפחמן '5. קצה זה נקרא קצה '5.

31. הסליל הכפול כל מולקולת דנ"א בנויה משני גדילים, המצויים זה מול זה בכיוונים מנוגדים "ראש אל זנב". שני הגדילים מחוברים ביניהם באמצעות זוגות של בסיסים. הבסיסים החנקניים, הבולטים משני הגדילים, נקשרים ביניהם בקשרים מימניים.

33. הסליל הכפול רק שני חיבורים אפשריים לקשר בין ארבעת זוגות הבסיסים: • אדנין נקשר רק עם תימין בשני קשרי מימן AT • גואנין נקשר רק עם ציטוזין בשלושה קשרי מימן. CG רצף הבסיסים בגדיל אחד קובע את רצף הבסיסים בגדילהאחר. שני גדילים הקשורים ביניהם נקראים גדילים משלימים (גדילים קומפלימנטריים).

34. תזכורת- אז מה היה לנו • 1- מבוא : • מהי ביולוגיה מולקולרית ובמה היא עוסקת • מהי הנדסה גנטית • מהם השימושיים המעשיים בשיטות אלו

35. תזכורת • 2- הכרת מושגי יסוד : • מבנה ואירגון ה-DNA :. • מבנה הכרומטין, נוקלאוזומים והיסטונים.

36. תזכורת • 2- הכרת מושגי יסוד : • בסיסי ה-DNA וכיווניות הגדילים.

38. היום • 3- הכפלת ה- DNA • תהליך ההכפלה הסמי-קונסרבטיבי של ה-DNA, הגדיל המוביל והגדיל • הנסוג. • ב- האנזימים המעורבים בתהליך ההכפלה

39. מקורות עזר וקריאה The Cell, ch.I-3, (Fundamentals of Molecular Biology) The Cell, ch.I-4 (The Organization of Cellular Genomes) The Cell, ch.I-5 (Replication, Maintenance, and Rearrangements of Genomic DNA)

40. הכפלת ה -DNA

41. כיצדמתקבלות שתי מולקולות דנ"א זהות ממולקולה אחת ? • כאשר תא מתחלק, מולקולת הדנ"א משכפלת את עצמה. • בתהליך השכפול, כל אחד מזוג הגדילים משמש תבנית ליצירת גדיל חדש. • כל תא מתאי הבת מקבל מולקולת דנ"א עם מכלול גנטי שלם, זהה לזה של תא האם.

42. הכפלת ה-DNA היא סמי-קונסרבטיבית • כל דו-גדיל מורכב מגדיל הורה מקורי שעל גביו נבנה גדיל חדש על ידי התאמת בסיסים מתאימים. כך נוצרים שני דו-גדילים חדשים זהים אחד לשני ולמולקולה המקורית. • מסלסון וסטאל הוכיחו תיאוריה זו ע"י גידול חיידקים על בסיס חנקן כבד ולאחר מכן העברתם למדיום המכיל חנקן רגיל. בדור השני גילו צפיפות חנקן שהיא חצי מזו של החנקן הכבד במולקולות ובדור השלישי גילו היברידים בין הצפיפויות.

43. סוגי ההכפלות אופן ההכפלה – שמרני (Conservative) שמרני למחצה (Semiconservative) מעורב Dispersive)) • הכפלה סמי-קונסרבטיבית (שמרנית למחצה). אם נכניס בסיסים מסומנים ונבדוק את אופן ההכפלה במבחנה = אחרי סיבוב אחד של הכפלה בכל גדיל תהיה תערובת של גדיל אחד חדש (מסומן רדיואקטיבית) וגדיל אחד ישן .

44. הכפלת ה – DNA : אנזימים מעורבים • טופואיזומרזות Topoisomerase • פותחות את מתח הגדיל • הליקאזות Helicase • שומרות על פתיחת הגדילים • דנ"א פולימראזות DNApolymerase • מסנטזות את הגדיל המוביל • רנ"א פרימזות (Primase) • יוצרות פריימרים של RNA להתחלת הגדיל המוביל ולהתחלות הגדיל הנסוג • דנ"א ליגאזות (Ligase) • מחברות את מקטעי ה-DNA שנוצרים

45. תכונות של דנ"א פולימארז I מבצע את פילמור (יצירת) שני הגדילים החדשים של ה-DNA. למעשה זהו קומפלקס חלבוני בעל מספר תכונות - • פעילות אקסונוקלאז מכיון 3 לכיוון 5 (' 3' to 5’ exonuclease activity), חיתוך הקשרים הפוספדיאסטרים מסופה של המולקולה ומעניקה לאנזים תכונה של "תיקון עצמי" Proofreading". כאשר מוכנס נוקלאוטיד לא נכון בתהליך השכפול, האנזים יכול לחסל אותו – בדומה לתהליך עריכה בהקלדת מסמך. • פעילות אקסונוקלאז מכיון 5 לכיוון 3 (5' to 3’ exonuclease activity), חיתוך הקשרים הפוספודיאסטרים בכיוון הסינטזה. מעניק לאנזים יכולת לחסל את הפרימר בזמן ההכפלה. • כדי להתחיל שיכפול לאנזים דרוש קצה 3'-OH ‘ מכאן נגזר שצריך פריימר.

46. השלבים בתהליך השכפול : השלב ראשון • שני הגדילים המפותלים, שבונים את הסליל הכפול של מולקולת הדנ"א,מתיישרים. • אנזימים מיוחדים (Topoisomerase) "מיישרים" את המולקולה על ידי פיתול הגדילים בכיוון מנוגד לכיוון הפיתול הרגיל.

47. השלב השני • לאחר היישור, שני הגדילים נפרדים זה מזה, כמו רוכסן שנפתח. • האנזים הליקאז"פורם" את הגדילים; הואגורם לניתוק קשרי המימן בין הגדילים. • אזור ההיפרדות דומה בצורתו לאות Y והוא נקרא מזלג השכפול. • מזלג השכפול מתקדם כל עוד נמשכת פתיחת הגדילים. • בתהליך השכפול יכולים להיווצר כמה מזלגות שכפול, לפי מספר אזורי הדנ"א שמכפילים את עצמם.

48. השלב השלישי • לאחר ההפרדה, משמש כל גדיל תבנית, אשר לפיה נבנה הגדיל החדש. • לאחר פתיחת הגדילים, מופיע בתא אנזים אחר(Primase) ש"בונה" קטע קצר של נוקלאוטידים על גדיל אחד של דנ"א, המשמש לו כתבנית. • הקטע הזה מכיל כ- 10 נוקלאוטידים והוא נקרא פריימר רק לאחר בנייתו של הפריימר, מתחיל הדנ"א פולימראז בעבודתו.

49. השלב השלישי • האנזים שבונה את שני הגדילים החדשים נקרא דנ"א פולימראז, זהו האנזים העיקרי שפועל בתהליך השכפול. • הפולימראז "מטייל" לאורך הגדיל הישן, ו"קורא" את רצף הבסיסים שלו. הוא "לוקח" מתוך מאגר הנוקלאוטידים, המצויים באופן חופשי בגרעין התא, את הנוקלאוטידים המתאימים, ומחבר אותם לגדיל המקורי, עד שמתקבל גדיל שני חדש.

50. השלב השלישי בפעולתו של הפולימראז יש מס' "בעיות": • האנזים דנ"א פולימראז "יודע" לבנות את שרשרת הדנ"א רק בכיוון של '5 ל- '3, ואילו במולקולת הדנ"א הגדילים מחוברים זה לזה בכיוונים מנוגדים ("ראש אל זנב"). • האנזים דנ"א פולימראז אינו מסוגל להתחיל בבניית גדיל חדש, אלא רק להאריך גדיל קיים.