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Chapter 13 Glycobiology and proteomics

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Presentation Transcript

  1. Chapter 13Glycobiology and proteomics 생명과학부 분자유전학실험실 유영희

  2. 1. Introduction 2. What is a glycoprotein ? 2.1. N-linked structure 2.2. O- linked structure 2.3. GPI-anchored structure 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics ? 3.1. Glycoproteins and fertilization 3.2. Glycoproteins and disease 4. Glycoanalysis in proteomics 4.1. recombinant glycoprotein ananlysis 4.2. gel-separated glycoproteins 5. Conclusion

  3. Introduction ◎ Development of proteomics - 적은 양(fmole)의 protein도 identify & characterize가 가능. ◎ genome과 proteom의 distinguishing feature ( in eukaryotic cells ) - gene product의 PTM (post-translational modification) - glycosylation이 predominant modification - protein의 modification은 protein function에 implicated - 그러므로 이러한 modification analysis는 different protein expression patterns를 이해하는데 중요.

  4. ◎ 많은 protein의 대부분은 glycosylation이 일어나며, glycoforms 은 pI and/or molecular mass에서 차이난다.

  5. This chapter 1. will try to address… - to gain an understanding as to how these glycosylation changes are reflected in the biology of an organism - glycan을 연구하는데 필요한 특별한 지식과 기술을 제공하여, 분석적인 방법을 이해하는데 도움을 준다.

  6. This chapter 2. Give some examples of the areas… - glycosylation has been found to have an important role - will hopefully convince the reader that the ananlysis of protein glycoforms is fundamental to the understanding of the proteom of the cell

  7. 2. What is a glycoprotein 1.Glycoprotein - nascent polypeptide chain에 하나 또는 그 이상의 saccharide unit의 enzymatic addition. - enzyme ◎ glycosyl transferase : oligosaccharide 합성하여 protein에 attach ◎ glycosidases : trim and degrade the glycan

  8. 2. Modificaton range from - single saccharides on proteins : collagens, nuclear glycoproteins - densely packed, comples, branched structures : mucins 3. Three main types of oligosaccharide - N-linked - O-linked - GPI(glycosyl phosphatidylinositol) anchored

  9. 2. What is a glycoprotein 2.1. N-linked structure - Sugar hooks onto Asparagine Residue. - Common Sugars attached are N- Acetylglucosamine (GlcNAc), and Mannose - Glycosylation occurs cotranslationally, in the Rough ER.

  10. 2. What is a glycoprotein 2.2 O-linked structure - Sugars hook onto Serine/Threonine residues. - Common sugars attached are N-Acetyl Neuraminic (Sialic) Acid and N-Acetyl galactoamine - Glycosylation occurs posttranslationally, in the Golgi.

  11. 2. What is a glycoprotein 2.3. GPI-anchored structure - have a identical saccaharide core consisting of Man3GlcNH2, which is a bridge between the phospholipid in the membrane and the protein.

  12. 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics ◎ proteomics - DNA 또는 mRNA 보다는 이것들에 의해 expresse 된 gene product에 초점 - biologically active function을 가진 mature protein으로 만 들어지는 과정인 PTM은 매우 dynamic ◎ human biology - fertilization과 disease에서 glycoprotein은 많은 interest를 준다.

  13. 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics 3.1. glycoprotein and fertilization 1. Oocyte와 sperm cell사이의 recognition에 중요한 역할 - Zona pellucida ( ZP ) : egg의 주위를 coating하고 있는 glycoprotein으로써 , sperm이 binding 한다.

  14. 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics 2. Glycoproteomic approach - fertilization에 관여하는 glycoproteins의 변화등을 연구하여 contraception 과 fertility studies에 응용할 수 있다. - fertilization에 관여하는 glycoprotein의 example : progesterone-regulated uterine glycodelins glycodelin A glycodelin S

  15. 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics 3.2. glycoproteins and disease 1.Initial stages of disease - glycoprotein이 종종 structure와 function에 있어서 변화를 보인다. - 이러한 변화는 disease의 progress chart가 될 수 있다.

  16. 3. Why are glycoproteins of interest in proteomics 2. Proteomic approach - diseased와 normal tissue에서 다르게 발현되는 protein의 identification - 이러한 proteins은 diagnose and/or disease control 연구에 focus가 될 수 있다. - 많은 glycoprotein은 그것들의 glycosylation에서의 특유의 변화를 일으키므로 abnomal한 metabolism을 유도할 수 있다. (table 1참고) - 2-D : protein expression에 있어서 differentially displaying changes를 결정할 수 있는 널리 쓰이는 방법.

  17. 4. Glycoanalysis in proteomics ◎ Carbohydrate analysis - initially, complex의 chemical and physical structure(very high molecular mass polysaccharides) 에 focus - technique의 발달 : 적은 양의 protein을 좀더 빠르고 정확하게 분석 - mass spectrometry(MS)의 등장이 매우 적은양의 carbohydrates와 glycopeptides의 분석을 가능하게 함.

  18. 4. Glycoanalysis in proteomics 4.1. recombinant glycoprotein analysis - 대부분의 therapeutic and diagnostic proteins는 glycosylation되어 있다. - expression시, condition과 cell line 등에 따라 glycosylation을 다양하고 differentially하게 조절할 수 있다. - 가장 많이 사용되는 분석방법은 electrophoresis : high throughput, comparative analysis and resolution 때문이다. : IEF, capillary electrophoresis, 2-DE

  19. 4. Glycoanalysis in proteomics 4.2 gel separated glycoprotein - 1-D 또는 2-D에 의해 separated된 protein의 glycosylation structural changes는 purify된 glycoprotein의 양적인 면이 limiting factor로 작용하였다. - MALDI-MS 또는 ESI-MS이 glycoprotein isoforms에 존재하는 oligosaccharide structure를 분석할 수 있는 가장 promising한 technologies

  20. 4. Glycoanalysis in proteomics 4.2.1 spatial resolution ( array ) 1. Separation ( IEF strip에 sample loading ) - passive rehydration : 적은양의 protein이 loading - cup loading : 많은 양의 protein이 loading 2. Staining - glycoprotein은 특별한 staining 방법이 필요 - example : lectin and hapten recognition protocols fluorescent staining ( faster, sensitive visualization of glycoproteins in PVDF blot)

  21. 4. Glycoanalysis in proteomics Cup load Passive rehydration - 같은 종류의 protein을 같은 양 loading 했을 경우에 위와 같이 passive보다는 active rehydration이 sample loading 시 더 효과적이다.

  22. 4. Glycoanalysis in proteomics 4.2.2 characterization -

  23. 4. Glycoanalysis in proteomics ◎ MALDI 또는 ESI의 MS의 빠른 발전은 protein 분석에 많은 revolutionized되고 있다. - N-linked oligosaccharide : 3500Da이 넘는 mass의 특성 때문에 MALDI-MS에 의한 분석이 어렵다. - O-linked oligosaccharide : N-linked oligosaccharide에 비해 mass가 작아서 분석이 가능 ◎ capillary zone electrophoresis - 매우 적은 pI차이도 resolving 할 수 있다. - reference ( HONDA,1998 and Taverna, 1998 ) - 상대적으로 많은 양의 sample이 필요하다. (uM)

  24. 4. Glycoanalysis in proteomics ◎ MALDI-MS - sensitive, rapid, easy - automated approach of identification of protein from a known genome - protein identification이 적은 fraction만 가지고도 가능 ◎ 그림 - protein을 database 통해서 identify - sample의 대부분은 microcharacterization ( modification의 여부를 identify ) - protein modification을 위한 방법으로는 LC-ESI-MS - fully characterize glycosylation

  25. 4. Glycoanalysis in proteomics

  26. 4. Glycoanalysis in proteomics ESI has proved to be more successful than MALDI-TOF in ionizing glycoproteins/glycopeptides

  27. 4. Glycoanalysis in proteomics ◎ glycoprotein의 difficult - proteins의 glycoforms structure를 완전하게 characterization 하기 위해서는 sugar의 mass의 정확한 측정이 요구된다. - peptide mass fingerprinting에 사용되는 amino acid masses와 비교해 볼 때 많은 monosaccharide residues는 같은 mass를 가지며, 그러므로 MS에 의해 쉽게 그 linkage와 sequence가 결정되지 못한다.

  28. 4. Glycoanalysis in proteomics 4.2.3 informatics - bioinformatic 분야는 mass database를 통해 큰 impetus를 가지게 됨 - glycosylation data의 interpretation을 위한 database 구축이 필요하다. : 이렇게 축적된 data를 바탕으로 glycoprotein를 analysis

  29. 5. conclusion ◎ protein의 PTM은 protein의 active한 function에 중요하다. 그러므로 modification된 protein의 분석이 중요한 의의를 갖는다. ◎ glycoprotein을 분석하는 tools가 발달하고 있으며, 분석을 통해 얻어진 data를 바탕으로 bioinformatic tools을construct 해야 한다.