1 / 42

Základy sérológie - prednáška 11

Základy sérológie - prednáška 11. Antigény - Protilátky - typy, štruktúra, špecificita,úloha Dynamika tvorby protilátok Sérológické testy. Antigén. Látka vyvolávajúca odpoveď imunitného systému - imunitnú reakciu - špecificky proti nej a reagujúca s produktami takejto reakcie.

amos-mcleod
Download Presentation

Základy sérológie - prednáška 11

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Základy sérológie - prednáška 11 • Antigény - • Protilátky - typy, štruktúra, špecificita,úloha • Dynamika tvorby protilátok • Sérológické testy

  2. Antigén • Látka vyvolávajúca odpoveď imunitného systému - imunitnú reakciu - špecificky proti nej a reagujúca s produktami takejto reakcie. • Imunogén - látka vyvolávajúca imunitnú reakciu • Haptén - látka schopná reagovať s produktami imunitnej reakcie. Samotný nevyvoláva imunitnú odpoveď, len po väzbe s nosičskou molekulou. Takýto konjugát má determinanty hapténu aj nosiča, typ nosiča ovplyvňuje vlastnosti konjugátu ako celku

  3. Imunogenicita • Cudzorodosť - imunitný systém odlišuje medzi vlastným a cudzím tak, že len cudzorodé molekuly sú imunogénne • Veľkosť - priamo úmerne - molekula musí mať hmotnosť minimálne 5 kD, aby bola imunogénna. Menšie molekuly len v prítomnosti adjuvns • Chemické zloženie - čím komplexnejšia molekula tým imunogénnejšia. Proteiny, polysacharidy, nukleové kyseliny, lipidy • Fyzikálne vlastnosti - korpuskulárne antigény : solubilné antigény • Schopnosť byť degradované - ľahko fagocytované sú imnogénnejšie (fagocytóza, spracovanie, degradovanie, prezentovanie T bunkám prostredníctvom APC)

  4. Schopnosť imunitne reagovať • Genetické faktory - druhovo závislá schopnosť, individuálne ovplyvnená - responders, non-responders. Neprítomnosť alebo alterácia génov kódujúcich receptory na T alebo B bb, podmieňujúcich prezentáciu antigénu prostredníctvom APC • Vek - deti do 3. roku - polysacharidové antigény. Starí - zlá odpoveď na antigény, hypoproteinémia Spôsob podania • Dávka - hraničná dávka, • Cesta - s.c., i.v., i.g., • Adjuvans - zvyšujú imunitnú odpoveď slabých imunogénov

  5. Typy antigénov • T independentný Ag - na T bunkách nezávislý - priamo stimuluje B lymfocyty k premene na plazmatické bb a tvorbe protilátok. Sú to obvykle polysacharidy s polymérnou štruktúrou - opakujúce sa antigénne determinanty reagujú s veľkým počtom molekúl imunoglobulínov, reakcia je stále rovnaká, tvorba IgM protilátok Niektoré (T1) sú schopné vyvolať polyklonálnu aktiváciu B lymfocytov. T2 - nie. Odolávajú degradácii. • T dependentné - niekoľko kópií viacerých antigénnych determinán. Vyvolajú tvorbu protilátok len prostredníctvom T lymfocytov. Proteinové antigény

  6. Antigénne determinanty - epitopy • Imunitný systém nerozpoznáva inf. agens ako celok. Reaguje s oblasťami s výraznou antigénnou štruktúrou na povrchu cudzorodej látky - epitopmi. Tvar epitopu, jeho elektrónova konfigurácia, reaguje s paratopom - časťou protilátky alebo receptoru na T lymfocytoch.Viacstupňová ochrana. • Determinanty rozpoznávané B bb. - lineárne, sekvenčné - primárna štruktúra , alebo sekundárna, terciárna, kvartérna štruktúra - konformačné. Malé a limitovný počet • Determinanty rozpoznávané T bb. - primárna sekvencia aminokyselín. (Tbb nerzopoznávajú polysacharidové ag a NK). Epitopy nemusia byť na povrchu, rozpoznanie T lymfocytmi vyžaduje ich proteolytické spracovanie a prezentáciu prostredníctvom APC a MHC molekúl.

  7. Superantigény • Bežné T dep. antigény aktivizujú len malú časť T bb. 10-100 000 - mono/oligoklonálna aktivácia • Superantigény - aktivizujú až 25% všetkých T lymfocytov - polyklonálna aktivácia - búrlivá reakcia • Stafylokokový enterotoxin, Stafylokokový toxín toxického šoku STST, Stafylokokový exfoliačný toxín SSS….

  8. Špecificita antigénov • Prekrývajúce sa epitopy • Podobné epitopy • Štrukturálna špecificita - chemická odlišnosť • Distribučná špecificita - Epitop je súčasťou antigénu iného typu molekuly (glukózový zbytok je súčasťou molekuly X aj Y -tá istá protilátka bude reagovať len na inom mieste • Skrížená reaktivita - niektoré bakteriálne antigény a antigény na ery - heterofilné antigény

  9. Protilátky • Imunoglobulíny - glykoproteinové molekuly produkované plazmatickými bb ako odpoveď na imunogén, ktoré plnia funkciu protilátky. • Behring a Kitaso - krvné sérum imunizovaných zvierat obsahuje látky špecificky neutralizujúce imunizujúcu látku - toxin. (antisérum) • Elektorforéza séra - globulínové frakcie obsahujúce protilátky -5 tried imunoglobulínov. Najviac vo frakcii gama.

  10. Štruktúra protilátok • Základná štruktúra imunoglobulínovej jednotky • 2 identické ťažké a 2 identické ľahké reťazce disulfidické väzby - ťažké a ľahké navzájom a 2 ťažké spolu - inter-chain - intra-chain • Variabilné a konštantné oblasti - na základe variability aminokyselín sú ťažké aj ľahké reťazce rozdelené: VL CL VH CH • analýza sekvencií aminokyselín variabilných oblastí ľahkých aj ťažkých reťazcov ukázala existenicu hypervariabilných oblastí- HVR (alebo komplementaritu určujúcich oblastí CDR).Ab s rôznou špecificitou majú rôzne HVR oblasti - oblasť s rozmanitosťou am.k. ktoré predstavujú priamy kontakt s Ag • flexibilná kĺbová oblasť - • Domény - ťažké ani ľahké reťazce nie sú ploché, ale sú to priestorové oblasti - domény

  11. Imunoglobulínové fragmenty rozloženie papainom v kĺbovej oblasti, • 2 Fab fragmenty - 2 identické fragmenty (ľahký reťazec a VH a CH1 ťažkého reťazca) - obsahujú antigén viažúce miesta - antigen binding - ab - protilátka viaže rôzne antigénne determinanty pretože má zvláštnu kombináciu VL a VH + • 1 Fc fragment (kryštalizujúci) - obsahuje 2 ťažké reťazce obsahujúce každýCH2 CH3. Efektorová funkcia imunoglobulínu • rozloženie pepsinom - rozpustenie inter chain väzieb a vznik F(ab´)2 - divalentný fragment, ktorý obsahuje obidve väzobné miesta, viaže Ag, ale nemá efektorovú funkciu

  12. Triedy, podtriedy, typy a subtypy • Triedy - 5 - na základe odlišností v sekvencii aminokyselín v konštantnej oblasti ťažkých reťazcov (CH): IgG, IgM, IgA, IgD, IgE • Podtriedy - menšie rozdiely sekvencií aminokyselín v CH : IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 • Typy - podľa typu ľahkých reťazcov - rozdiely v sekvencii aminokyselín v konštantnej časti ľahkých reťazcov - kappa ľahké reťazce, lambda ľahké reťazce • Subtypy - podľa rozdielu sekvencie aminokyselín v konštantnej oblasti lambda reťazcov na lambda 1,2,3,4, Heterogenita - imunoglobulíny sú populáciou veľmi heterogénnou oblasti ľahkých reťazcov, naviac sa odlišujú rôznymi vlastnosťami pre väzbu rôznych antigénov vo variabilných oblastiach ťažkých a ľahkých reťazcov(typy, subtypy, triedy podtriedy)

  13. Izotyp, allotyp, idiotyp • Izotyp - antigénne determinanty, ktoré charakterizujú triedy a podtriedy - ťažkých reťazcov a typy a podtypy ľahkých reazcov.Každá trieda, podtrieda, typ a podtyp imunoglobulínov má vlastný súbor izotypových determinant. Sú viazané na Fc fragment a sú spoločné pre druh. • Allotyp - predstavujú malé rozdiely v sekvencii ťažkých a ľahkých reťazcov rôznych jedincov .Lokalizované na konštantnej oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov. • Idiotyp - jedinečná antigénna determinanta prítomná na molekulách protilátky rovnakej špecificity v hypervariabilnej oblasti. Lokalizované v Fab fragmente

  14. IgG • Monomér • podtriedy sa odlišujú počtom disulfidických väzieb v kĺbovej oblasti • tvorí 75% sérových Ig, najpočetnejší aj v extravaskulárnom priestore • Jediný prechádza placentárnou bariérou, na bunkách placenty sú reťazce pre Fc oblasť IgG (IgG2 neprechádza) • Viaže komplement (IgG4 nie) • Viaže sa na makrofágy, monocyty, PMNL, a niektoré lymfocyty - internalizácia antigénu. Opsonizácia antigénu • Polčas rozpadu - 21 dní

  15. IgA • Sérový IgA - monomér • Sekrečný - dimér s J reťazcom a proteinom T, ktorý je produkovaný epiteliálnymi bunkami a je priložený k IgA při prechode do sekrétov. Chráni ped degradáciou enzýmami v sekrétoch a při transporte cez mukózu. • 2. najčastejší v sére, najčastejší v slzách, slinách, kolostre - lokálna imunita • neviaže komplement • viaže sa na PMNL a niektoré lymfocyty • polčas 6 dní

  16. IgM • Pentamér (normálne) - 5 identických monomérov viazaných J reťazcom, aj jako monomér • Prvý sa vytvára v plode aj po stimulácii B buniek • Dobre viaže komplement. IgM sú veľmi účinné pri lýze mikroorganizmu. Dobre aglutinuje • Polčas 5 dní • Viaže sa na Fc fragment niektorých bb. • IgM na povrchu B bb je monomér, ale má naviac 20 aminokyselín, ktorého zakotvujú do membrány. Je tu receptorom pre antigén (T independentný). Po ich kontakte prechádza signál k aktivácii B bb na premenu na plazmatické bb. U T dependentného antigénu je potrebný ešte signál od T helper bb

  17. IgD • Monomér • veľmi nízke hladiny v sére • úloha nejasná • nachádzajú sa na povrchu B bb s extra aminokyselinami na C konci- ako receptor pre antigén - • neviaže komplement • polčas 3 dni

  18. IgE • Monomér s extra doménov v konštantnej oblasti • najmenej častý v sére • viaže veľmi pevne Fc receptor na basofiloch a mastocytoch aj pre väzbou s Ag • Po väzbe s Ag dochádza degranulácii vazoaktívnych látok z buniek - prejavy alergie • úloha při parzitárnych ochoreniach - Fc receptor pre IgE na eosinofiloch, IgE obaľujú parazity a táto väzba vedie k zabitiu parazitov • neviaže komplement • polčas 2 dni

  19. Funkcia - špecificky viažu 1 alebo niekoľko veľmi podobných antigénov. Každý Ig viaže špecifickú antigénnu determinantu - epitop svojim paratopom. - efektorová funkcia - následok špecifickej väzby Ag+Ab - sprostredkovanie väzby komplementu, alebo väzby na rôzne typy buniek - PMNL, lymfocyty, trombocyty, bazofily, eozinofily…..

  20. Rozpoznávanie antigénu • Imunitný systém vznikol k ochrane proti cudziemu - škodlivému. Nesmie rozpoznávať vlastné. Na tom sa podieľajú 2 systémy humorálny (protilátky) a celulárny (bunky). • Humorálny - protilátka je rozpoznávacia molekula humorálneho systému - cirkuluje v krvi a tekutinách alebo je prítomná na povrchu B lymfocytu. Po kontakte so špecif. antigénom transformuje b. lymfocyt na plazmatickú bunku, ktorá produkuje identické protilátky • Celulárny - receptor na povrchu T lymfocytu rozpoznáva len fragment antigenu, ktorý mu predložili APC bunky vo väzbe na MHC. MHC jeviazaný na povrch buniek, preto T lymfocyty rozpoznávajú ag len viazané s bunkami

  21. Rozmanitosť protilátok - suma možných Ab špecificít, ktoré organizmus môže vytvoriť • Ag si vyselektuje zo všetkých protilátok len tie, ktoré sa viažu na jeho epitop = obrovské množstvo rôznych protilátok • Paratop imunoglobulínu je tvorený HVR oblasťami ľahkých a ťažkých reťazcov. Ktorýkoľvek ľahký sa môže spojiť s ktorýmkoľvek ťažkým. Teoreticky je možné vygenerovať 107 rôznych špecificít. • Genetická výbava pre tvorbu ťažkého reťazca ( oblasť V(200), D(12) a J(4 možností) = 200x12x4x9600 pre tvorbu ľahkého reťazca V(200) a J(5)=200x5=1000 1000x10 000=10000000=107

  22. Klonálna selekcia • B aj T lymfocyty pri svojom vývoji v lymfatickom tkanive získajú určitú špecificitu paratopu, ktorý rozpozná len určitý epitop antigénu. Po skutočnej väzbe takéhoto epitopu na zodpovedajúci paratop dôjde k selektovanej proliferácii a dozrievaniu danej bunky a vzniku dcérskych bb s rovnakými genetickými determinantami

  23. Syntéza protilátok • Tvorba protilátky po expozícii antigénu - lag fáza, logarytmická, plató, pokles • B lymfocyty sú stimulované k tvorbe IgM protilátok, po určitej době môže dôjsť k prepnutiu - změna na IgG protilátky, prípadne k stimulácii pamäťových buniek • Pri ďalšom stretnutí s tým istým antigénom je lag fáza kratšia, bunky sú v rôznej fazí aktivácie, protilátky sa detekujú skôr a vo vyššej koncentrácii. Produkujú sa aj IgM ale v nízkej koncentrácii - produkujú ich B lymfocyty, ktoré vznikli až po predošlej expozícii

  24. Význam špecifických protilátok v diagnostike • Mikroorganizmus (cudzí antigén) vyvolá tvorbu špecifických protilátok: • IgM sú detekovateľné po 7-14 dňoch , MX v sére po 3 mesiacoch, vymiznú - podľa stimulácie po 3-6 mesiacoch - akútne • IgG sú detekovateľné po 14-21 dňoch a ich pokles je pomalý, niektoré pretrvávajú celoživotne - protektívne • Pri detekcii celkových protilátok - štvornásobný vzostup titra v odstupe 14-21 dní alebo serokonverzia z negativity na pozotivitu.

  25. Reakcia antigénu s protilátkou • Ag s protilátkou vytvára imunokomplexy, čím sa obmedzuje šíreni antigénu, umožňuje sa fagocytóza, aktivizuje sa komplement, dochádza k lýze bakteriálnej bunky. Protilátky sú účinné len proti antigénom, ktoré nie sú internalizované

  26. Sérologické reakcie • Reakcia • známy antigén + neznáma protilátka (v sére)- nastavenie reakcie podľa vlastností antigénu, protilátky a toho, čo chceme dokázať. Pomer antigénu a protilátky. Nadbytok Ag alebo Ab • Prostredie • Spôsob vizualizácie

  27. Aglutinácia • Korpuskulárny antigén: protilátky proti nemu aglutinujú - zhlukujú - antigén IgM sú dobre aglutinujúce protilátky • Reakciu môžme postaviť na dôkaz antigénu alebo protilátky • Na zlepšenie vizualizácie môžme použiť nosič (latexové čiastočky, erytrocyt s naviazaným antigénom -pasívna hemaglutinácia) • Efekt prozoony • Priama, nepriama, kvalitatívna, kvatitatívna • Hemaglutinačne inhibičný test

  28. Precipitácia • Komplex antigénu s protilátkou vytvorí precipitačnú líniu - test CRP v kapilárach, alebo v agare • radiálna imunodifúzia Mancini - antigén je inkorporovaný do agaru, sérum je nakvapkané do vytvorených jamiek. Ak je prítomná protilátka, difunduje do agaru a spojí sa s Ag - vytvorí precipitačnú líniu • Imunodifúzia podľa Outcherlonyho • Imunoelektorforéza

  29. Neutralizácia • Vírus + sérum s protilátkami = inhibícia životných prejavov vírusu

  30. KFR • Reakcia spotreby komplementu: • Reakcia antigénu s protilátkou spotrebuje komplement ak je protilátka prítomná • po pridaní hemolytického systému zvieracie erytrocyty + protilátka proti erytrocytom nezostal komplement na hemolýzy erytrocytov - reakcia je pozitívna • ak v prvej časti reakcii nie je protiláka, komplement sa nespotrebuje a zostane k dispozícii pre druhú časť reakcie - dôjde k hemolýze - reakcia je negatívna

  31. ELISA • Na povrch polystyrénovej jamky je naviazaný antigén. Sérum, v ktorom hľadáme protilátky pridáme do jamky. Ak v sére je protilátka, naviaže sa na antigén, ktorý pevne lpie na povrchu jamky. Nenaviazanú protilátku odplaví při premývaní voda. • Pridáme ďalšiu protilátku (komerčnú označenú farbičkou, alebo enzýmom, ) proti hľadanej protilátke v sére. Ak je naviazan na platničku cez antigén, naviaže sa aj komerčná protilátky. • Túto potom môžme detekovať podľa zmeny farby.

  32. Imunofluorescencia IFT • Na podložnom sklíčku máme antigén, pridáme sérum s hľadanou protilátkou, ktorá vytvorí pevný komplex. Pridáme ďalšiu protilátku - proti hľadanej protilátke - označenú fluoresceínom. Ak vznikol komplex antigén, protilátka, 2.protilátka s fluoresceinom - vo fluorescenčnom mikroskope sledujeme fluorescenciu.

  33. Western blot • Na prúžku papiera je nanesená a elektroforézou rozložená antigénna štruktúra vírusu alebo baktérie. • Pridáme na prúžok sérum. Ak obsahovalo protilátky proti vírusu alebo baktérii naviažu sa zodpovedajúcom mieste prúžku. Po pridaní ďalšej protilátky proti komplexu ag-ab s farbičkou, sa zviditeľnia na prúžku. • Môžme oddiagnostikovať prítomnosť protilátok proti viacerým antigénom mikroorganizmu

  34. Dynamika tvorby protilátok po podaní antigénu

  35. Afinita a skrížená reaktivita protilátok

  36. Imunodifúzia

  37. Závislosť aglutinácie na ekvivalentnom pomere ag a ab

  38. Princíp hemaglutinácie a fenoménu prozóny

  39. Princíp ELISA testu

  40. Princíp imunofluerescenčného vyšetrovania protilátok

  41. Význam a limity serologických reakcií • Prítomnosť protiálok poskytuje obraz o anamnéze pacientových infekcií • identifikácia mikroorganizmu, jeho typu • stanovenie priebehu ochorenia, chronicity na základe protilátok proti jednotlivým antigénom, ktoré sú prítomné v rôznom období ochorenia. • Titer - obrátená hodnota riedenia séra, v ktorom došlo k reakcii • Falošná pozitivita, negativita, skrížené reakcie. • Liečime pacienta s ochorením a nie sérologické titre

  42. HODNOTENIE SEROLOGICKÝCH REAKCIÍ Kvalitatívna reakcia: pozitívny alebo negatívny (porovnaním s hraničnou hodnotou) Kvantitatívna reakcia: titer protilátok alebo koncentrácia Určovanie protilátok celkových (KFR,aglutinácia .....) – dynamika tvorby protilátok – 2 vzorky v odstupe 14 dní – výsledok sa udáva ako riedenie séra a alebo ako titer protilátok Určovanie jednotlivých tried imunoglobulínov -IgM, IgA včasné, akútne ochorenie - IgG neskoré, protektívne, dlhodobé výsledok sa udáva v koncentráciu – g/l Dôkaz akútneho ochorenia štvornásobný vzostup alebo pokles titra protilátok, konverzia z negativity na pozitivitu dôkaz IgM protilátok

More Related