Étapes …

1. Toxico-dynamique Exposition Toxico-cinétique Étapes …

3. Mécanismes de cytotoxicité Génotoxicité Cycle cellulaire/ Stress oxydant Prolifération Epigénétique Signalisation Cellulaire Apoptose / Nécrose Métabolisation Santé mitochondriale Atteintes à la membrane Cytosquelettes

4. Étude de la Génotoxicité

5. Test de Mutagenèse : Test Ames (1) • Developed by Bruce Ames and his colleagues in the 1970s. • Tests the mutagenicity of different compounds • Is used by FDA to test many chemical rapidly and inexpensively • Uses special bacteria that are very sensitive to many mutagenic agents

6. Characteristics of mutants strains of S.typhimurium used for Ames Test • cannot synthesize histidine. • are very susceptible to additional mutations because they lack the normal repair mechanisms found in bacteria. • more permeable than wild-type bacteria to external chemicals, including potential mutagens.

7. Different mutant strains of S.typhimurium with different mutations in their DNA • TA 1535 has a base substitution that produces a missense mutation in the gene coding for the first enzyme of histidine synthesis. The mutant enzyme has a proline where a leucine is in the wild-type enzyme. • TA 100 is very similar to 1535, but is also supposed to detect a different range of mutagens. • TA 1537 has a frameshift mutation (deletion of one nucleotide) in a different gene than is mutated in 1535. • TA 1538 has a different frameshift mutation (insertion of one nucleotide) in the same gene that is mutated in TA 1537. • TA 98 is similar to 1538 but is supposed to detect more mutagens than 1538 does. • TA 102 is significantly different from the others. It has an ochre mutation which means that it has a nonsense mutation. This mutation occurs in the same gene as is mutated in the strain TA 1535.

9. Test de Mutagenèse : Test Ames (2)

10. Mise en évidence de la fragmentation de l’ADN sur gel d’agarose

11. Induction de micro-noyaux Substance génotoxique ADN • Fragments chromosomiques ou isolement de chromosomes entiers • Migration anormale pendant la mitose • Pas d’incorporation dans les noyaux des cellules filles • Condensation + Membrane Micronoyaux Visualisation par coloration spécifique et appréciation de leur taux comparé au taux de base

12. Induction de micro-noyaux

13. Induction de micro-noyaux

14. Induction de micro-noyaux

15. Vit E prévient la production de micronoyaux • Prévention partielle quelle que soit la concentration en Zen

16. Test d’Aberrations Chromosomiques Fusions centriques Cassures

17. Anneaux Lacunes (Gap)

18. Induction d’aberrations chromosomiques Mutation Research, 365, 139-149. (2005)

19. Test de Comète (SCGE) Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) : Technique d’électrophorèse qui permet la détection de cassures de l’ADN (différents types de dommages) sur des cellules individualisées

20. Cellule individualisée La Comète Nucleide; ADN compact Nucleoid; ADN relaché  Préparartion des lames : Inclusion des cellules dans de l’agarose sur lames de microscope  Lyse:Triton X-100, 2.5 M NaCl  Déroulement de l’ADN : pH alcalin  Electrophorèse:pH> 13 • Les boucles d’ADN cassé migrent vers l’anode formant la queue de la comète Neutralisation  Coloration de l’ADN  Microscopie à Fluorescence Analyse (100 comètes) • % ADN dans la queue est liée à la fréquence des cassures

21. Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé Noyau endommagé Noyau fortement endommagé

22. Analayse d’image par ordinateur • Longueur • % ADN dans la queue(% ADN migrant) • Moment (ADN migrant x Longueur)

23. Classe 1 Classe 0 Classe 2 Classe 3 Classe 4

24. DNA damage (Arbitrary units score) W. Hassen & H. Bacha / 2ème Colloque Euro-Méditerranéen 13-16 Nov. 2006