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第 10 章基因诊断 Gene diagnosisChina Medical University Department of Medical Genetics p480

本章内容提示 基因诊断概念基因诊断方法直接诊断（Southern）间接诊断（PCR-RFLP） DNA多态基因诊断实例：

第一节基因诊断技术 第二节基因诊断方法及实例

基因诊断： 利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。传统的诊断：表现型→基因型基因诊断：基因型→表现型（逆向诊断）

基因诊断的特征： 1 不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等 2 症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病 3 产前诊断避免患儿出生，提高人口质量

第一节基因诊断技术 Southern印迹杂交

基因诊断技术 Northern印迹杂交

基因诊断技术 点样 Probe-32P 检测 A B 斑点杂交 1 2 3 4

基因诊断技术 荧光原位杂交

基因诊断技术 聚合酶链反应

基因诊断技术 ☆多重PCR 在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失 E1 E2 E3

基因诊断技术 ☆RT-PCR 以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA 用于研究基因表达使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度

基因诊断技术 ☆PCR-SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism）单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。

基因诊断技术 --------------------------- primer --------------------------- ↓ 32P-dNTP掺入PCR扩增产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓ 1为正常结果分析 2、4、5为纯合患者 3为杂合子 .

基因诊断技术 生物芯片

第二节基因诊断方法及实例 直接诊断——直接检测致病基因的突变基因突变类型——缺失、点突变、重复、插入等间接诊断——应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 DNA多态——RFLP、VNTR、SNP

一 DNA多态 DNA多态（DNA Polymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。

DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类： 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。

一) 限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP • 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP • RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。

Allele II 产生了新的酶切点 12Kb Allele I 12Kb 8Kb 4Kb 8Kb Allele II probe RFLP—Southern blot检测结果

AlleleII酶切位点消失

二)数目变异串联重复，variable number tandem repeats, VNTR） • 重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR。 • 散在分布于染色体上。 • 重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。重复单位2~6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。

VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。 • DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）

VNTR 酶切，电泳后的检测结果 大小

PCR-VNTR检测

PCR-VNTR

三)单核苷酸多态性（SNP） （Single Nucleiotide Polymorphism） SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代　　根据SNP在基因中的位置，分为：基因编码区SNP 基因周边SNP 基因间SNP 在人类基因组中每100~300个核苷酸就有一个SNP

二、基诊断方法及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。直接基因诊断及实例

直接基因诊断—突变型遗传病的直接基因诊断 e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断

e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断 1）Southern blot β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAG——GTG 谷Aa——缬Aa

已知限制酶Mst 1识别序列（CCTNAGG） • CCTGAGG • CCTGTGG • 突变后不能识别， • 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

2) ASO探针诊断 已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。 Normal βΑGene Probe——与正常 Probe βΑ杂交稳定 Mutation βS Gene Probe——与异常 βS杂交稳定

等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） （Allele-specific-oligonucleotide ）

突变型遗传病的直接基因诊断 斑点杂交结果： βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针突变探针

突变型遗传病的直接基因诊断

直接基因诊断—缺失型遗传病的直接基因诊断 1） 地中海贫血的基因诊断 BamHI BamHI α2 α1 基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。 14 kb α2 probe 10 kb

缺失型遗传病的直接基因诊断 Southern blot 检测结果： αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - - 正常缺1 缺2 缺3 缺4 14kb 10kb

缺失型遗传病的直接基因诊断 • 2）β地贫的Gene诊断 • β珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点， pst1酶切正常可得到4.4kb片段 • β珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切则得到3.7 kb片段为β0

以βGene为探针，Southern blot 方法检测 • βΑ/βA βΑ/β0 β0/β0 4.4kb 3.7kb 缺失型遗传病的直接基因诊断

缺失型遗传病的直接基因诊断 3） DMD的基因诊断 DMD属XR DMD基因是最大的基因，有79个外显子 DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位 E1 E2 E3

缺失型遗传病的直接基因诊断 病例 1 2 3 4 5 6 7 8 bp 外显子 535 Pm 3 43 50 13 6 47 60 52 113

二）间接基因诊断方法及实例 当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。

间接基因诊断 连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。遗传标记是基因组中的DNA 多态如：RFLP，VNTR 等。

间接基因诊断 相关基因表型分析遗传标记

间接基因诊断 1 Southern blot--RFLP诊断(PKU) PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。

间接基因诊断 • 患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁 • 其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。 • II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。

间接基因诊断 2 成年型多囊肾病的诊断 • 例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 • APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过ＲＦＬＰ连锁分析进行诊断。

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Ch 18- Volcanic Activity