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PCR 常见问题、原因分析及其对策

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PCR 常见问题、原因分析及其对策 - PowerPoint PPT Presentation


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PCR 常见问题、原因分析及其对策. 主讲人:欧阳志荃. 主讲内容. PCR 技术简介. PCR 技术简介. PCR 常见问题、原因分析及其解决方案. 提高 PCR 反应特异性的策略. PCR 标准反应体系. DNA 模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH 2 O 耐热聚合酶. 反应体系对 PCR 扩增的影响. DNA 模板. 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制 PCR 反应 完整性 模板降解会导致 PCR 扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当 、 避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融

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Presentation Transcript
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主讲内容

PCR技术简介

PCR技术简介

PCR常见问题、原因分析及其解决方案

提高PCR反应特异性的策略

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PCR标准反应体系
  • DNA模板
  • 引物
  • 反应缓冲液
  • dNTP
  • ddH2O
  • 耐热聚合酶
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反应体系对PCR扩增的影响

DNA模板

  • 纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应
  • 完整性模板降解会导致PCR扩增无产物
  • 浓度加量过多导致非特异性扩增增加
  • 特异性长度适当、避免二级结构和二聚体
  • 完整性避免反复冻融
  • 浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则

引 物

扩增产物太少

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反应体系对PCR扩增的影响

  • pH值,盐离子浓度
  • 稳定剂,增强剂

反应Buffer

  • 过高非特异性严重
  • 过低无扩增产物

Mg 2+浓度

  • 浓度适当
  • 避免反复冻融

dNTP Mixture

  • pH值适当
  • 避免污染

ddH2O

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PCR标准反应体系
  • DNA模板
  • 引物
  • 反应缓冲液
  • Mg 2+
  • dNTP
  • ddH2O
  • 耐热聚合酶
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如何选择最合适的DNA聚合酶

  • DNA 聚合酶的特性
  • PCR实验的不同需求
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如何选择最合适的DNA聚合酶

-- DNA 聚合酶的特性

纯 度

稳定性

酶活性

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如何选择最合适的DNA聚合酶

-- PCR实验的不同需求

特 异 性

基因组扩增、RT-PCR

保 真 性

基因筛选、测序、 基因克隆

长片段扩增

构建基因图谱、测序、分子遗传学

扩增效率

复杂模板扩增(GC含量高、二级结构)

PCR试剂盒

复杂模板扩增、大规模基因检测

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- 热启动 Taq酶

特异性

原 理

特 点

用 途

  • 蜡封
  • 抗体抑制
  • 化学修饰
  • 避免非特异性扩增
  • 提高PCR反应的
  • 基因组扩增
  • RT-PCR

特异性

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— 高保真酶

保真性

原 理

用 途

  • 3’-5’核酸
  • 外切酶活性
  • 降低碱基错配率
  • 表达基因的克隆
  • 基因的定点突变
  • 细胞内基因点突变分析(SNP)
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高保真 + 高扩增效率

原 理

用 途

  • 混合酶
  • -高扩增效率
  • - 3’-5’核酸外切
  • 超长片段扩增

-测序

-构建基因图谱

  • 复杂模板扩增

-GC含量高

-二级结构

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PCRMasterMix

原 理

    • 预配好的PCR反应液
  • DNA聚合酶
  • 反应缓冲液
  • dNTP
  • PCR增强剂
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PCRMaster Mix

特 点

  • 快速简便 减少加样误差和污染
  • 灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板
  • 特异性强 降低PCR反应的要求,增强特异性
  • 稳定性好 长期放置活性无改变

适用范围

  • 大规模基因检测
  • 目的基因拷贝数极低的样本
  • GC含量高,有二级结构的模板
  • 复杂基因组样本
  • 可直接检测菌落,基因点突变检测,

或者阳性克隆的筛选。

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PCR技术简介

PCR常见问题、原因分析及其解决方案

PCR常见问题、原因分析及其解决方案

提高PCR反应特异性的策略

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PCR常见问题
  • 无扩增产物
  • 非特异性扩增
  • 拖尾
  • 假阳性
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PCR常见问题之一
  • 无扩增产物
  • 现象:正对照有条带,而样品则无;

原因

  • 模板:含有抑制物,含量低
  • Buffer对样品不合适
  • 引物设计不当或者发生降解
  • 反应条件:退火温度太高,延伸时间太短
  • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
  • 更换Buffer或调整浓度
  • 重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物
  • 降低退火温度、延长延伸时间

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PCR常见问题之二
  • 非特异性扩增
  • 现象:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
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PCR常见问题之二
  • 非特异性扩增

原因

  • 重新设计引物或者使用巢式PCR
  • 适当降低模板或引物浓度
  • 适当减少酶量
  • 降低镁离子浓度
  • 适当提高退火温度或使用二阶段温度法
  • 减少循环次数
  • 引物特异性差
  • 模板或引物浓度过高
  • 酶量过多
  • Mg2+浓度偏高
  • 退火温度偏低
  • 循环次数过多

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PCR常见问题之三

M 1 2

  • 拖尾
  • 现象:产物在凝胶上呈Smear状态。
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PCR常见问题之三
  • 拖尾

原因

  • 模板不纯
  • Buffer不合适
  • 退火温度偏低
  • 酶量过多
  • dNTP、Mg2+浓度偏高
  • 循环次数过多
  • 纯化模板
  • 更换Buffer
  • 适当提高退火温度
  • 适量用酶
  • 适当降低dNTP和镁离子的浓度
  • 减少循环次数

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PCR常见问题之四
  • 假阳性(筛选转基因、检测基因表达情况)
  • 现象:空白对照出现目的扩增产物
  • 原因:靶序列或扩增产物的交叉污染
  • 对策:
  • 操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
  • 除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
  • 各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存。
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PCR技术简介

PCR常见问题、原因分析及其解决方案

提高PCR反应特异性的策略

提高PCR反应特异性的策略

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四种策略
  • 巢式PCR(Nest-PCR)
  • 递减PCR(TouchDown PCR)
  • 热启动PCR(HotStart PCR)
  • 使用PCR增强剂
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策略之一

P2

P4

P1

P3

  • 巢式PCR(Nest-PCR)
  • 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性,因为同多套引物都互补的靶序列很少。
  • 巢式PCR可以增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,并且提高了困难PCR(如5' RACE)的特异性。
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策略之二
  • 递减PCR(TouchDown PCR)
  • 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。
  • 特异性最高的目的模板会被优先扩增,这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。
  • 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用,如AFLP、DNA指纹分析等。
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策略之三
  • 热启动PCR (HotStart PCR)
  • 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到PCR仪达到变性温度;
  • 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售,该酶具有热启动的性能,使用简单方便,适合于高通量应用;
  • 热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。
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策略之四
  • 使用PCR增强剂
  • 甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。
  • 其可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。
  • 增强剂浓度要适当
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