第四章样品的全息制备

第四章样品的全息制备 1 生物大分子的制备 2 蛋白质（酶）的分离纯化

1 生物大分子的制备 1.1 概述 1.2 生物大分子制备的前处理 1.3 生物大分子的分离纯化 1.4 样品的保存

1.1 概述 　　在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，如果没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前提，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。

　　与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：　　与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴ 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵ 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多、流程长。 ⑶ 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷ 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 ⑸ 生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同。

生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ① 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ② 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ③ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ④ 生物材料的破碎和预处理。 ⑤ 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑥ 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 ⑦ 产物的浓缩、干燥和保存。

① 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③ 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④ 各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 ⑤ 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 ⑥ 对其他生物分子的特殊亲和力。要了解生物大分子的物理、化学性质主要有：

各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。　　生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。　　目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。

1.2.1 生物材料的选择 　　制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。　　选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。　　动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。　　植物要先去壳、除脂。　　微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。　　生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 1.2 生物大分子制备的前处理

　　不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。　　不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 (1) 机械法： ①研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆。 ②组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后再用10000～20000r/min的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎。 1.2.2 细胞的破碎

(2) 物理法： ①反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室温（或40℃）迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 ②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 ③压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 ④冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

(3) 化学与生物化学方法： ①自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 ②溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 ③酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 ④有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。

“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。通常：　　极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；　　碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；　　温度升高，溶解度加大；　　远离等电点的pH值，溶解度增加。 1.2.3 生物大分子的提取影响提取的因素主要有：　　目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；　　由固相扩散到液相的难易；　　溶剂的pH值和提取时间等。注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。

1.3 生物大分子的分离纯化 　　由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。　　为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。　　常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。

1.3.1 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅适用于实验室中，也可用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。　　沉淀法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

1.3.2 透析 在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术。　　透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量 (MwCO) 通常为10KD左右。　　用1％BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％AgNO3 检查NaCl、KCl等。

1.3.3 超滤 　　超过滤即超滤，是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。

超滤工作原理示意图 受压的生物大分子和小分子溶液浓缩的生物大分子小分子溶液

1.3.4 冰冻干燥 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见下图：

三相点相图

制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下： ①以分子大小和形态差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。 ②以溶解度差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。 ③以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 ④以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。 1.3.5 分离纯化方法的选择

　　生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。　　生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。 ⑴空气：空气空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。 ⑵温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。 1.4 样品的保存影响生物大分子样品保存的主要因素有：

⑶水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。⑶水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。 ⑷光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。 ⑸样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度十分重要。 ⑹时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。

2 蛋白质（酶）的分离纯化 2.1 酶活性测定 2.2 酶溶液制备 2.3酶分离纯化的基本过程 2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 2.5 调节溶解度的分离方法 2.6 按电荷的正负性设计的分离方法 2.7 根据亲和作用建立的纯化方法 2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法

抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。 (1)要注意防止酶的变性失活. (2)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。 (3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。酶的分离提纯包括三个基本环节：根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:

2.1 酶活性测定 　　酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度（指初速度）可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，其单位为mol/s。 2.1.1 酶的活力单位 2.1.2 摩尔催化活性/分子活性和转化率（催化中心活力）

Vmax=K0[E] K0=Vmax/[E] K0即为转换率(也用Kcat表示)，如果每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，如果一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。每种酶的转换率不同，下表列出了几种酶的转换率：摩尔催化活性 (Molar Catalytic Activity) 表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：

2.1.4 酶活力的测定方法 　　酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 2.1.4.1 终止反应法 (Stopped Method) 　　　终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。　　　使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用 SDS 使酶失活或加热使酶变性等。　　　产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。 2.1.3 比活力比活力 (性) (Specific Activity)是酶纯度的量度，指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用 IU/mg 蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。

⑴ 酶法 　　酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖 + O2 → 葡萄糖内脂 + H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:

　　由于4-甲氧联酚在 435nm 波长处有光吸收峰，因此、只要测定 A435，就可知 4-甲氧联酚的量，可得H2O2的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶 (过氧化物酶) 必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在 5 倍以上。偶联法中偶联酶对反应速度的影响

再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 　　　葡萄糖＋ ATP → 葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P + NADP+ → 6-P-葡萄糖酸 + NADPH + H+ 这时即可测定 340nm 处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。

(2) 化学法 　　化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。化学分析法的优点是：不需要特殊仪器，一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。　　缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。　　目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。

⑶ 放射性化学法 　　是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性。　　优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。　　缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如 3H 发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。

　　连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。　　连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。 ⑴ 一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 2.1.4.2 连续反应法 (Continuous Method)

几种连续法的例子

　　是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件 (pH、温度等) 下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。　　如醛缩酶 (Aldolase) 催化1,6-二磷酸果糖生成3-P-甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙糖异构酶 (Triose Phosphate Isomerase) 作偶联酶 (Coupling Enzyme)、甘油-1-P-脱氢酶 (Glycerol-1-Phosphate Dehydrogenase) 作指示酶，依据 NADH 变成 NAD+ 的光谱变化来算出醛缩酶活性。　　如下图： ⑵ 偶联的连续法

醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法

2.1.4.3 酶活力测定中应注意的几个问题 　　酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的—些特点。首先，测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在 5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。　　其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是一个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。　　第三，反应必须在酶的最适条件（如最适温度、pH 和离子强度等）下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度 (v) 对酶浓度(E) 作图，应得一条通过原点的直线，即 v 为 (E) 的线性函数。

　　初速度的确定是在底物浓度[S]足够的条件下，通过[E]的变化来确定，如下图。由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。　　初速度的确定是在底物浓度[S]足够的条件下，通过[E]的变化来确定，如下图。由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。　　求得几个适当时间的反应速度（反应量/反应时间）。再用反应速度对酶量作图。由图可见，其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。

　　这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为:　　这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为: O2·﹣+ O2·﹣+2H+ → H2O2 + O2 由于 O2·﹣在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。目前已有根据 O2·﹣的物理性质测定 O2·﹣的歧化量，从而直接测定SOD活力的方法。如电子顺磁共振波谱法 (ESR)、核磁共振法 (NMR)、紫外分光光度法等。这里只介绍以邻苯三酚法测定酶活力为例的化学法。　　邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实验条件下（见操作），抑制率达到50%时的SOD的浓度为 1 个酶单位。 2.1.4.4 酶活性测定实例 (1) 超氧化物歧化酶 (SOD) 活力测定

　　测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同的仅是在加入缓冲液后再加入 10μl 待测样品即可。酶活力计算方法：用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有10μl ，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。操作：在试管中加入pH8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液4.5ml，于25℃保温20min，然后加入预热的45mmol/L连苯三酚溶液（对照管用10mol/L HCl代替）10μl，迅速摇匀倒入1cm比色杯，每隔 30s 在 325nm 处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在 0.070 OD/min。单位体积活力(u/ml) = {([(0.07 - 样品速率)/0.07]×100%)/50%} ×反应液总体积×(反应液稀释倍数/样液体积) 总活力 = 单位体积活力(u/ml)×原液总体积

　　糖苷酶的活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下，糖苷键断裂，产生等当量的糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性。　　糖苷酶的活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下，糖苷键断裂，产生等当量的糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性。操作：试管中加入 5mmol/L 对硝基苯基糖苷200ul，pH4.6的0.2mol/L 磷酸氢二钠和 0.1mol/L 柠檬酸配制的缓冲液200ul，37℃预保温10min，再加入χμl待测样品并用水补足到100ul，37 ℃反应15min，用0.5mol/L Na2CO3 1ml终止反应 (注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品)，在 400nm 处测定 A 值，酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯酚的量为1 个单位的酶，对照标准曲线，即可计算出酶活力。 (2)糖苷酶的活力测定

　　酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。　　酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。 2.2.1 材料预处理及破碎细胞酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：一是释放到细胞外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶．叫溶酶；三是牢固与膜或细胞颗粒结合在—起的，叫结酶，后二者合称胞内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。微生物胞外酶，用盐析，或单宁沉淀。有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取，其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞，也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳，以免单宁等物质着色污染。　　进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化学方法两大类： 2.2 酶溶液制备

2.2.1.1物理粉碎法 (1)研磨手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在实验室中使用较好的方法。 (2)机械捣碎匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎。 (3)高压法在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在2-15℃下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。 (4)爆破性减压法将菌体悬浮在N2/CO2高压下平衡，37℃振荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎。 (5)专用波振荡专用波振动通过液体时形成局部减压，叫空化作用，旋涡生成与消失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。 (6 )快速冰冻融化法由于突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内外浓度突然改变，可使某些细胞破碎。

2.2.1.2 化学法 (1)渗透作用将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬于含蔗糖、EDTA的稀的Tris缓冲液中，待平衡后离心，加入MgCl2剧烈搅拌，可使某些水解酶从细胞内释放出来。 (2)干燥处理干燥方法可用空气干燥、真空干燥、冷冻以及脱水干燥。如空气干燥，一般在25-30 ℃或高到35-40℃的气流中吹干，然后将干菌体悬浮于3-5倍的水中或缓冲液中，室温搅拌2-3h抽提。 (3)自溶向菌体中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使细胞渗透性改变，保温一定时间后，可以使菌体自溶。 (4)溶菌酶处理用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上多糖分子的β-1,4-糖苷键，从而破坏细胞壁。 (5)酶处理作用于细胞壁的酶有白细胞酶、溶菌酶等，用以处理细胞，使酶释放出来。 ⑹表面活性剂处理膜结合酶在细胞破碎后很难溶解下来，常借助表面活性剂来解决。在适当pH及离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。 ⑺其他如当细菌感染噬菌体后，噬菌体附着于菌体细胞壁，导致菌体自溶等。

　　由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。　　由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。　　抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。 2.2.2.1 pH 　　选用pH，首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的pH稳定范围。　　其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。　　第三，在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出发，选用 pH 4-6为佳。 2.2.2 抽提

2.2.2.3 温度 　　温度通常控制在0-4℃左右。如果酶比较稳定，可以例外，如胃蛋白酶可在37℃保温抽提。 2.2.2.4 抽提液用量抽提液用量常采用原料量的1-5倍。有时，为了抽提效果好些需要反复抽提时，抽提溶液比例可能大些。 2.2.2.2 盐大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.020-0.050 mol/L的磷酸缓冲液、0.15mol/L NaCl等；常用到的还有焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液，有助于切断酶和其他物质的联系；据报道，少数情况下用水抽提亦佳，这可能与低渗破坏细胞结构有关。 2.2.2.5 其他在细胞破碎以后，某些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提系统带来不稳定的因素，因此有时还要加入一些物质。例如：加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白酶破坏目的酶；为防止氧化，加入Lys或维生素C、惰性蛋白及底物等。

2.2.3 酶溶液的净化与脱色 　　在酶的抽提液或发酵液中常含有细胞、细胞碎片等固形物质和蛋白质、粘多糖、脂类和核酸等大分子物质，通常应通过离心或过滤而净化。由于发酵液浓度较大，细胞颗粒微小（细菌细胞只有1-l0μm），相对密度只有1.03，有些细菌细胞表面带负电荷与发酵胶液流动电位电荷相互排斥；由于细胞壁外层的多糖、蛋白质等生物大分子与水结合成水化层而形成疏水强的稳定颗粒，这些在生产上为酶溶液的离心或过滤净化处理带来困难，通常需要使用絮凝剂后才能净化。

　　提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1-1％，因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等，这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段；还有真空浓缩及冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。　　提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1-1％，因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等，这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段；还有真空浓缩及冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。 2.2.4 浓缩

2.3 酶分离纯化的基本过程 2.3.1 酶分离纯化方法的选择在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质，其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质。核酸及其相关蛋白可以用硫酸鱼精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2预先沉淀，离心除去、必要时，可用核酸酶。根据不同材料选择不同的试剂。比如从植物组织中提取乙醇酸氧化酶。可在提取液中0.1-0.2％硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形成复合物而沉淀，然后在4℃采用10,500r/min离心而除去.至于粘多糖，常用醋酸铅、乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白，因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。

第四章 样品的全息制备