第六章 酶

1. 第六章 酶 Enzyme 生物化学教研室 吴映雅

2. 问题： • 1. 没有加热、点燃，如此温和条件下，体内的化学变化是如何启动、停止，如何控制快慢的？ • 2. 一个细胞内就有成千上万的化学反应，同时进行如何不会紊乱？

3. 第一节 酶的分子结构Molecular structure of enzyme 什么是酶？ • 酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂Biocatalysts。 • An enzyme is a biological catalyst催化剂, usually a protein蛋白质, but in some cases it can be RNA. • 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymatic reaction。 • Substrate底物: Reactants in enzyme-catalyzed reactions are called substrates. Substrates bind to the enzyme to start the reaction.在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物。

4. 一、酶的分子组成 单纯酶-------------脲酶、消化酶类 simple enzyme 蛋白质部分 （酶蛋白）Apoenzyme 酶 全酶Holoenzyme 结合酶 Conjugated enzyme 非蛋白质部分 （辅助因子）Cofactor 金属离子： K+、Mg2+…… 小分子有机物： Vit类物质 辅基 Prosthetic group 辅酶 Coenzyme

5. 金属辅助因子的作用 • 1. 作为酶活性中心的催化基团参与催化反应，传递电子； • 2. 作为连接底物和酶分子的桥梁，便于酶对底物起作用； • 3. 为稳定酶的构象所必需； • 4. 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。

6. 辅酶Coenzyme是指与酶蛋白结合不牢固，可以用透析或超滤的方法除去的物质；辅酶Coenzyme是指与酶蛋白结合不牢固，可以用透析或超滤的方法除去的物质； • 辅基Prosthetic group是指与酶蛋白结合牢固，不能用透析或超滤将其除去的物质。 • 总体来说，辅助因子承担着传递电子、原子或基团的作用，决定了酶催化的反应类型。

7. 表6-1　某些含B族维生素的辅酶(或辅基)在催化中的作用表6-1　某些含B族维生素的辅酶(或辅基)在催化中的作用

8. 决定酶特异性的是酶蛋白部分，而辅酶或辅基决定了反应的类型。决定酶特异性的是酶蛋白部分，而辅酶或辅基决定了反应的类型。 • 通常一种酶蛋白必须与某一特定的辅酶(辅基)结合，才能成为有活性的全酶Holoenzyme。 • 一种辅酶可与多种不同酶蛋白结合，而组成具有不同特异性的全酶。 • eg: NAD+可以与不同的酶蛋白结合，组成乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶等。

9. 二、酶的活性中心active center(site) • 活性中心（活性部位）active center－是酶蛋白构象的一个特殊区域，能与底物特异结合，并催化发生反应生成产物。 • 酶的必需基团essential group —— 酶分子发挥催化功能所不可缺少的基团。 • 位于活性中心外：维持酶蛋白构象所需； • 活性中心内： • 结合基团binding group：负责与底物结合 • 催化基团catalytic group：改变底物中某些化学键的稳定性，使底物发生反应生成产物。

10. 单体酶monomeric enzyme:酶仅由一条多肽链构成。 • 寡聚酶oligomeric enzyme:酶是由几个乃至几十个亚基subnuit(每个亚基为一条多肽链)，以非共价键连接成多聚体而存在。 • 多酶体系multienzyme system：在细胞内存在的由几种代谢上相互联系的酶彼此嵌合形成多酶复合物，更有利于化学反应连续进行, 称多酶体系。 • 多功能酶 multifunctional enzyme :由一条多肽链构成，但含多个不同的活性中心，可催化不同的反应。

11. 第二节　酶促反应的特点和机制 • 一、酶促反应的特点Characteristic of enzyme-catalyzed reaction • (一)酶的催化效率极高 • (二)酶催化的反应具有高度的特异性 酶对其所催化的底物具有较严格的选择性。即一种酶仅作用于一种或一类化合物，或作用于一定的化学键，以催化一定的化学变化，得到一定的产物，这种现象称为酶的特异性或专一性(specificity) • (三)酶的不稳定性instability: 酶的蛋白质的化学本质 • (四)酶催化活力与酶量的可调节性

12. 酶促反应比非催化反应高108－1020倍，比一般催化反应高107－1013倍酶促反应比非催化反应高108－1020倍，比一般催化反应高107－1013倍 • 酶促反应机制： • 降低活化能 activation energy 图：酶促反应活化能的改变

13. A catalyst increases the rate of a chemical reaction by lowering the activation energy, which is the barrier to be overcome in going between the initial and final state. 酶的催化作用是通过大幅度降低化学反应的活化能。使活化分子相对增多，反应速度加快。

14. 二、酶促反应的机制 • (一)决定酶作用高效率的机制 • ⒈邻近效应(proximity effect)与定向排列(orientation arrange) 提高底物有效浓度，诱导底物形成转变态 • ⒉表面效应(surface effect) 形成活性中心的疏水性“口袋” • ⒊多元催化(multielement catalysis) 酸碱两性，多重协同催化

15. (二)决定酶作用特异性的机制——诱导契合学说 Induced Fit Model substrate Complex of substrate-enzyme Enzyme 当酶分子与底物接近时，酶分子与底物相互诱导，双方构象发生变化，形成过渡态以利于酶与底物结合，结合成复合物后，底物最易受酶催化攻击，促进底物发生化学反应。

16. 三、酶原与酶原的激活Zymogen and the activation of zymogens • A zymogen is an inactive precursor of an enzyme that is converted to the active form by cutting off a portion of the peptide chain. • 酶原zymogen：有些酶在细胞内合成或初分泌时，只是酶的无活性前体，必须在某些因素参与下，水解掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生改变，而表现出酶的活性。这种无活性酶的前体称为酶原。酶原向酶转化的过程称为酶原的激活。酶原的激活实际上是酶的 活性中心形成或暴露的过程。

17. Pepsinogen胃蛋白酶原and Pepsin胃蛋白酶: Zymogen and Enzyme. • Pepsinogen胃蛋白酶原is a zymogen-------a large polypeptide that is cleaved into a somewhat smaller one that is an active enzyme. • Pepsinogen胃蛋白酶原is catalytic inactive and doesn’t degrade the proteins in the cells that make it. • It is secreted into the stomach, where strong acid and active enzyme (including pepsin胃蛋白酶 itself) cleave it to form pepsin, the active enzyme.

18. There important digestive enzymes----chymotrypsin糜蛋白酶, pepsin胃蛋白酶and trypsin胰蛋白酶------are synthesized合成as inactive precursors: chymotrypsinogen糜蛋白酶原, pepsinogen胃蛋白酶原, and trypsinogen胰蛋白酶原, respectively. They are synthesized in the acinar cells 腺泡细胞of the pancreas胰腺and stored as membrane-bound zymogen granules颗粒. • The proteins involved in the blood clotting process are activated in similar fashion by a cascade mechanism.

19. 胃蛋白酶原 胃蛋白酶+6个多肽片段 胰蛋白酶原 胰蛋白酶+六肽 糜蛋白酶原 糜蛋白酶+2个二肽 H+或胃蛋白酶 Ca++肠激酶或胰蛋白酶 胰蛋白酶或糜蛋白酶

20. 酶原与酶原激活的生理意义 • 1. 安全转运----对于蛋白酶来说，通过酶原与酶原激活现象可以避免细胞产生的蛋白酶对细胞自身进行破坏，并使之在特定部位发挥作用。 • 2. 安全存储---酶原可以视为酶的贮存形式。 eg:凝血和纤维蛋白溶解酶类以酶原的形式在血液循环中运行，一旦需要便转化为有活性的酶，发挥其对机体的保护作用。

21. 四、同工酶Isozymes （ isoenzymes） • Isozymes (also known as isoenzymes) are enzymes that differ in amino acid sequence but catalyze the same chemical reaction. These enzymes usually display different kinetic parameters (i.e. different Km values), or different regulatory properties. • 同工酶------是指能催化同一化学反应，但酶蛋白的分子组成、结构、理化性质乃至免疫学性质和电泳行为都不同的一组酶。

22. L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，LDH) • LDH是由H亚基(即心肌型)和M亚基(即骨骼肌型)组成的四聚体。这两种亚基以不同比例组成5种不同的同工酶 。 各种不同类型的LDH同工酶在不同组织器官中的比例是不同的。

23. 同工酶虽然催化相同的反应，但可有不同的功能 。 • 心肌中含量最多的是LDH1（H4）对NAD+有较大的亲和力，易受丙酮酸抑制，它的作用主要是催化乳酸脱氢生成丙酮酸，有利于心肌利用乳酸氧化供能。骨胳肌中含量多的LDH5，对NAD+亲和力低，不受丙酮酸的抑制其作用是催化丙酮酸加氢生成乳酸，有利于骨胳肌生成乳酸。

24. 肌酸激酶（creatine kinase CK）是二聚体，其亚基有M型 （肌型）和B型（脑型）两种，脑中含CK1（BB型）；骨骼肌中含CK3（MM型）；CK2（MB）型 仅见于心肌。 • 同工酶在各组织中的分布和含量有很大差异。 • 血清同工酶谱的测定已用于临床。心肌梗塞后6~18小时，CK2释放入血。而LDH的释放比CK2迟1~2天。正常血浆LDH2的活性高于LDH1，心肌梗塞时可见LDH1大于LDH2。

25. 第三节　酶促反应动力学Kinetics of Enzymatic Reaction • The rate or velocity速度of a biochemical reaction is defined as the change in the concentration of a reactant or product per unit time. • 影响酶促反应的因素： • 酶浓度、底物浓度、温度、 • 酸碱度（pH）、抑制剂inhibitor、激活剂activator等。

26. Vmax v [E] 一、酶浓度对酶促反应的影响Initial rate is proportionate to enzyme concentrationV∝[E] V∝[E]

27. Vmax v Km [S] 二、底物浓度对酶促反应速度的影响 • 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 • 当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

28. 二、底物浓度对酶促反应速度的影响 • The rate of the reaction is directly proportional (first order reaction一级反应) to substrate concentration only when [S] is low. • When [S] becomes sufficiently high that the enzyme is saturated饱和, the rate of the reaction is zero-order零级反应with respect to substrate.

29. Increase Substrate Concentration 0 1 2 3 4 5 6 7 8 80 60 40 20 0 Product 0 2 4 6 8 Substrate (mmole) S + E ↓ P (in a fixed period of time) Juang RH (2004) BCbasics

30. Essential of Enzyme Kinetics E S Steady State Theory E E + + P S In steady state, the production and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant. Juang RH (2004) BCbasics

31. Michaelis equation • 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol/L。 • 米氏方程 • Km 即为米氏常数Michaelis constant， • Vmax为最大反应速度

32. 米氏常数Km的意义 • ⒈Km值为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度 • 2.不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 • 3.Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • 4. It may reflect the affinity亲和力 of the enzyme for its substrate.Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。

33. Km: Affinity with Substrate Vmax[S] vo = Km+[S] Vmax Ifvo = 2 Vmax Vmax[S] = 2 Km+[S] Km+[S] = 2[S] Km= [S] Km When using different substrate Vmax S2 S1 S3 1/2 S1S2S3 Juang RH (2004) BCbasics Affinity changes

34. Km: Hexokinase Example CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Substrate Glucose Allose Mannose number 1 2 3 4 5 6 Km = 8 8,000 5 mM Juang RH (2004) BCbasics

35. Km值和Vmax值的测定 • 1 Km 1 1 •  =  +  • VVmax [S] Vmax • y = m x + b

36. An Example for Enzyme Kinetics (Invertase) 1 vo vo 1 Vmax - 1 Km 1/S S 1)Use predefined amount ofEnzyme→E 2)Add substratein various concentrations →S(x 軸) 3)MeasureProductin fixedTime (P/t) →vo(y 軸) 4)(x, y)plot get hyperbolic curve,estimate→Vmax 5)Wheny = 1/2 Vmaxcalculatex ([S]) →Km Vmax 1/2 Juang RH (2004) BCbasics Km Double reciprocal Direct plot

37. 双倒数作图法double reciprocal plot slop=Km/Vmax (intercept on the vertical axis) -1/Km 1/Vmax (intercept on the horizontal axis)

38. 三、温度对酶促反应速度的影响 optimum temperature最适温度: Temperature at which the enzyme operates at maximal efficiency. ·低温～最适温度,T↑ V↑ ·60℃ ,酶蛋白开始变性 V↓ · 80℃以上,酶蛋白几乎全部变性失活 · 0℃或以下,V几乎等于0，但酶不变性,温度回升，酶活性又恢复

39. 四、pH对酶促反应速度的影响 • optimum pH酶的最适pH :The pH value at which an enzyme’s activity is maximal is called the pH optimum.。 • 不同种类的酶具有不同的最适pH • 偏离最适pH , 酶活性↓ V↓ • pH值过高或过低都会使酶活性降低甚至变性、失活。

40. pH dependent of enzyme activities Enzyme activity Acetylcholinesterase Amylase Pepsin pH

41. 五、抑制剂对酶促反应速度的影响Enzyme inhibition • 凡能抑制酶促反应的物质，统称抑制剂(inhibitor) • 根据抑制剂与酶结合的紧密程度不同，酶的抑制作用分为可逆性抑制reversible与不可逆性irreversible抑制两类。 专一specific inhibitor 不可逆抑制作用 非专一Non specific inhibitor 抑制作用 竞争competitive 可逆抑制作用 非竞争noncompetitive 反竞争 uncompetitive

42. （一）不可逆抑制作用irreversible inhibition • 抑制剂与酶的某些必需基团以共价键的方式结合，引起酶活性丧失，又不能用透析、超滤等方法除去抑制剂而恢复酶活性的，称为不可逆抑制作用。

43. 乙酰辅酶A+胆碱→乙酰胆碱 → 乙酸 +胆碱 阿托品(-) 胆碱酯酶 有机磷农药(-) O O RO-P-X + HO-E RO-P-OE+HX O-R’ OR’ 有机磷化合物胆碱酯酶失活的酶

44. SH S E + Hg2+ E Hg SH S 巯基酶 失活的酶

45. （二）可逆性抑制作用reversible inhibition • 抑制剂与酶以非共价键结合，引起酶活性丧失，但能用透析、超滤等方法除去抑制剂而恢复活性的，称为可逆性抑制作用。 • 分类： • 竞争性抑制competitive inhibition • 非竞争性抑制non-competitive inhibition • 反竞争性抑制uncompetitive inhibition

46. E + + ES S E + P I EI （非共价键结合） 抑制程度决定于I/S 1、竞争性抑制作用: 抑制部位是酶的活性中心。 • 特点 :抑制剂与底物结构相似. • 抑制剂与底物结合在酶的同一位点 • 抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除. Km增大,Vmax不变.

47. 竟争性抑制

48. Competitive Inhibition C-OO- C-H C-H C-OO- C-OO- H-C-H H-C-H C-OO- C-OO- H-C-H H-C-H H-C-H C-OO- C-OO- H-C-H C-OO- C-OO- C-OO- Substrate Product Competitive Inhibitor Succinate Glutarate Malonate Oxalate Succinate Dehydrogenase Adapted from Kleinsmith & Kish (1995) Principles of Cell and Molecular Biology (2e) p.49

49. 丙二酸、苹果酸、草酰 乙酸为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

50. H2 N H2 N SO2NHR COOH 对氨基苯甲酸 二氢喋呤 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸 二氢叶酸还原酶 四氢叶酸 谷氨酸 磺胺药(-) TMP(-) 核酸→蛋白质 故SN抑制敏感细菌的生长、繁殖。 PABA SN （磺胺类药） (对氨基苯甲酸) Enzyme Inhibitors Are Extensively Used应用：磺胺类药物和对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 抑菌机理：