模块七典型产品

模块七典型产品

基因工程制药 概况基因工程产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。

基因工程产品生产流程 设计发酵反应器选择培养方式工程菌选择确定发酵培养基组分工艺优化与参数监控生物催化剂的使用计算机的应用基因工程药物的质控产品分离、纯化

工程菌选择 能用一般基因重组技术获得；有高产潜力；能以工业原料（碳源）为培养基；不致病、无毒性；生产工艺能用一般工业生产经验；代谢能控制；能产生、分泌蛋白质；产品有特异性；生产安全，符合国家卫生部门规定；发酵液黏度小；

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母表达系统 • 具有甲醇精确诱导调控的醇氧化酶（AOX）启动子PAOX； • 以甲醇作为唯一碳源和能源是其主要特征； • 三个阶段非常明显：生长期（不流加）、分批-补料培养、诱导表达。 • 表达产物的糖基化（糖蛋白，修饰加工，对重组蛋白的稳定性，免疫原性，生物活性均有影响）； • 有50%～70%的把握在毕赤酵母系统表达绝大部分蛋白，且达到相当水平，其中大部分可成为医药制品。

选择培养方式 （1）补料分批培养：注意溶氧、流加补料；（2）连续培养：两阶段连续培养，控制和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养：维持质粒稳定性。

与基因工程菌培养有关的几个问题 一、基因工程菌生长代谢的特点（1）菌体生长速率反映蛋白质的合成速度；（2）控制菌体生长可提高质粒稳定性，减少代谢副产物的积累和提高外源性蛋白产率；（3）能量的供应决定菌体的最大比生长速率；（4）小分子前体和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速率。二、菌体生长与能量（碳源）的关系

（1）菌体生长最大比生长速率由呼吸控制； （2）菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供的能量时，代谢副产物乙酸能抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时；（3）分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等；通过降低供能速度和前体供应速度来控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，避免乙酰辅酶A的积累，减少乙酸产生和抑制；在一定范围能控制菌体生长，实现高密度培养和提高产物的表达水平。

三、高密度细胞培养策略 （1）使用最低合成培养基；（2）控制比生长速率减少乙酸和乙醇等抑制性产物的积累，使碳源能更多地用于异源蛋白的表达；对分批-补料培养，控制补料流速；对连续培养，则控制稀释率D；（3）用碳源做限制性基质。四、菌体生长与前体的关系（1）培养基中加入氨基酸能提高菌体比生长速率，使蛋白合成增加。

（2）由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞（2）由于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而加剧了这些成分的不足；同样的培养基，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导基因表达后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。（3）在中等拷贝质粒（56）工程菌中，外源基因的复制、转录、翻译引起菌体内前体浓度的降低，可诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与宿主细胞比）。（4）在高拷贝质粒（240）工程菌中，前体大量被利用而引起不足，产生 “严紧反应”（ppGpp），核糖体及有关酶水平比宿主细胞低。

基因工程药物的产品分离、纯化 （1）目的产物在初始物料中含量较低；（2）含目的产物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差，易失活/变性；（4）生物活性物质种类繁多；（5）应用面广，对质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等； • 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。

分离纯化的基本过程 分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括: 细胞破碎固液分离浓缩与初步纯化高度纯化直至得到纯品成品加工

胞内产物 细胞破碎细胞分离碎片固液分离包含体细胞分离复性变性发酵液初步分离高度纯化胞外产物制剂产品浓缩

基因工程药物的质控 • 原材料的质量控制原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。目的基因、表达载体、宿主细胞 • 培养过程的质量控制（1）在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；（2）在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；（3）在重复发酵中，工程菌表达稳定；（4）始终能排除外源微生物污染。

纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；外源性蛋白质、 DNA与热原都控制在规定限度下。 • 目标产品的质量控制（1）产品鉴别 • 肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。 • 肽图分析结果与氨基酸成分和序列分析结果合并，作为蛋白质的精确鉴别。 • 氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。 • 部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。

（2）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定（2）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 • 浓度测定方法主要有：凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林－酚法和紫外光谱法等。 • 相对分子质量测定最常用的方法有：凝胶过滤法和SDS－PAGE法。凝胶过滤法是测定完整的蛋白质相对分子质量；蛋白质亚基的相对分子质量测定采用 SDS－PAGE法。（3）纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，包括：目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。

目的蛋白质含量测定：还原性及非还原性SDS－PAGE法、等电点聚焦、目的蛋白质含量测定：还原性及非还原性SDS－PAGE法、等电点聚焦、各种 HLPC、毛细管电泳（CE）等。 • 杂质：蛋白质、非蛋白质。 A 蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主细蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，其灵敏度可达百万分之一。同时需辅以电泳等其他检测手段对其加以补充和验证。 B 非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。

（4）生物活性测定 • 需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。（5）稳定性考察（6）产品一致性保证产品保存的质量控制 • 液态：低温、稳定pH、高浓度、加保护剂； • 固态

具体产品介绍 • 人胰岛素(Insulin)： • 国外人胰岛素的基因工程生产一般采用两种方式：（1）分别在大肠杆菌中合成A链和B链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。（2）另一种方法是用分泌性载体表达胰岛素原。如丹麦Novo用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。

人生长激素（Human growth hormone，hGH） • 人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。它有多种生物功能，主要是刺激身体生长。 • 瑞典Kabivitrum公司和美国Genentech公司采用重组大肠杆菌共同投资研究开发了重组hGH，商品名为Protropin。 • 干扰素（Interferon，IFN） • 干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。 • 干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是—种细胞素。可采用重组大肠杆菌生产。

抗生素 概况 • 根据抗生素的化学结构分类化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效。（1）β-内酰胺类；（2）氨基糖苷类；（3）大环内酯类；（4）四环类；（5）多肽类。

根据抗生素的生物合成途径分类 （1）氨基酸肽类衍生物；（2）糖类衍生物；（3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物。据统计，至2000年，全球抗生素年总产值达250多亿美元，其中头孢菌素类最多，约为150亿美元；青霉素55亿美元；其余50亿美元。

具体产品介绍 • 青霉素和头孢菌素C 青霉素和头孢菌素C都属于β-内酰胺类抗生素，特别是头孢菌素C是近年来国内外发展最迅速、新品种最多的一类抗生素。 • 生物合成机制头孢菌素C和青霉素结构非常近似，见下图。

异青霉素 N 的形成

青霉素的合成 青霉素是含有青霉素母核（6–APA）的一类化合物的总称。青霉素分子由两部分组成；一部分是酰基侧链；另一部分是母核。母核由β–内酰胺环（B环）和噻唑环（A环）组成，称为6–氨基青霉烷酸。其前体物质是 L–半胱氨酸和 L–缬氨酸。不同类型的青霉素的β–内酰胺环基上连接的侧链不同，抗菌能力也有差异。侧链是由α–氨基己二酸构成的。 • 1、前体、二肽及三肽的合成缬氨酸、半胱氨酸和α–氨基己二酸的合成：以葡萄糖为原料，经EMP途径产生丙酮酸。

两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶催化下，转变成乙酰乳酸，再经异构、两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶催化下，转变成乙酰乳酸，再经异构、还原和转氨等反应，形成 L–缬氨酸。 • 丙酮酸进入TCA循环，产生异柠檬酸，在异柠檬酸裂解酶催化下产生乙醛酸，再经还原、氨基化、巯基化反应最后形成 L–半胱氨酸。 • α–氨基己二酸是由α–酮戊二酸与乙酰CoA的二碳单位缩合生成高柠檬酸，再经脱羧、氨基化反应最后生成 L–α–氨基己二酸。 • L–α–氨基己二酸首先与L–半胱氨酸缩合形成二肽，然后L–缬氨酸的氨基与L–半胱氨酸的羧基缩合形成三肽。 L–缬氨酸在形成三肽的过程中，改变构型成D–型。

2、 β–内酰胺环的形成 • 在环化酶的催化下，三肽中的酰胺N原子与S原子相邻的C原子连接进行环化，形成β–内酰胺环。 • 3、噻唑环的形成 • 噻唑环的形成过程还不甚清楚，过去认为是由缬氨酸上的α,β碳原子脱氢形成双键，然后与半胱氨酸的巯基部分发生加成反应形成噻唑环。 • 但现在用同位素试验证实缬氨酸的异丙基完整的掺入了青霉素，否定了上述结论。

2、青霉素G、 6–APA 的形成 • 三肽化合物闭环以后，形成异青霉素 N，它是合成各种青霉素的前体，其中的侧链是α–氨基己二酸。 • 侧链α–氨基己二酸可以被酰基转移酶催化转换为其它侧链。如：在发酵液中加入苯乙酸，与α–氨基己二酸进行交换后，带上苯乙酸侧链就是青霉素 G。 • 异青霉素 N被青霉素酰化酶催化，使侧链裂解生成6–APA，它是合成各种半合成青霉素的主要原料。，

头孢菌素C的合成 • 头孢菌素C（即先锋霉素）由头孢菌产生，其结构与青霉素相似，是由酰基侧链和母核–氨基头孢霉烷酸组成，7–CAC结构中含有一个双氢噻唑环（A环）和一个β–内酰胺环（B环）。 • 头孢菌素C与与青霉素具有相同的前体物质。当三肽化合物闭环以后，形成异青霉素 N，其中的侧链L–α–氨基己二酸异构为D–型后，转变成青霉素 N。 • 青霉素 N在扩环化酶（即脱乙酰氧头孢菌素C合成酶）的催化下，使硫原子和缬氨酸的一个甲基之间脱氢，形成双氢噻唑环，生成脱乙酰氧头孢菌素C，在加氧酶、乙酰转移酶作用下，最后合成头孢菌素C。

氨基酸 • 氨基酸发酵机理和菌种选育 • 几乎所有的微生物都能在其代谢途径中合成氨基酸以满足细胞生长的需要，但是由于受到产物的反馈调节，细胞内各种氨基酸的浓度只能维持在生理浓度范围内，不会产生过量的积累。 • 当以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸代谢途径如下图所示。

从图中可得出氨基酸合成的如下特点： • 某一类氨基酸往往有一个共同的前体（如芳香族氨基酸的共同的前体莽草酸）； • 氨基酸生物合成与EMP途径TCA循环关系密切； • 一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体； • 根据以上特点要大量地积累氨基酸应该做到以下几点： • 必须解除代谢途径中存在的产物反馈调节； • 防止合成的目标氨基酸降解或用于合成其它细胞组分； • 若几种氨基酸有一个共同的前体应切断其它氨基酸的合成途径； • 应增加细胞膜的通透性。

氨基酸生物合成的基本调节机制有两种：反馈控制和在合成氨基酸生物合成的基本调节机制有两种：反馈控制和在合成途径分支点处的优先合成。 • 氨基酸生产菌种的改造方法：诱变育种，基因工程。 • 根据已掌握的微生物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，发酵法生产氨基酸的菌种选育主要有：营养缺陷型、代谢调节突变株及基因工程菌。 • 营养缺陷型菌种： ① 积累直线型代谢途径中间产物氨基酸；如 L-鸟氨酸的生产， ② 积累分支代谢途径末端的氨基酸；如赖氨酸的生产。 • 其实质是降低反馈作用物的浓度，必须严格控制缺陷营养物质在亚适量水平，否则生产不稳定，因为此种微生物体内酶的代谢调节机制并未被解除。

代谢调节突变株： 营养缺陷型菌种不能用于积累直线型代谢途径末端氨基酸，只有选育代谢调节突变株才能达到目的。一是抗氨基酸结构类似物的突变株；二是从营养缺陷型进一步得到某种调节酶缺失的回复突变株（营养缺陷和调节突变结合型）。 • 基因工程菌：生产 L-色氨酸（大肠杆菌）、L-苏氨酸（55 g/L）。

谷氨酸代谢调控机制 • 谷氨酸产生菌可以从自然界筛选得到（谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌）。最初筛选得到的菌种积累谷氨酸不超过30 g/L，通过不断的诱变育种，目前生产谷氨酸的工业菌种产谷氨酸能力超过100 g/L，甚至达到150 g/L。 • 但是，从自然界筛选其他氨基酸生产菌种并不容易，这是由这些氨基酸在细胞内的代谢机理所决定的。 • 其他氨基酸生产菌几乎都是从谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌通过诱变育种或基因工程技术获得的，这是氨基酸发酵菌种的一大特点。 • 谷氨酸生物合成途径 EMP 途径；HMP 途径；TCA 循环；DCA 循环； CO2 固定

由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径

研究证明： • 谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径有关的酶； • 谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果酸酶，与谷氨酸得率正相关； • TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关； • 以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷氨酸生成期此循环应关闭。

谷氨酸代谢调控机制 ①谷氨酸脱氢酶 ②-酮戊二酸脱氢酶 ③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ④柠檬酸合成酶 NH4+ 在黄色短杆菌中谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调节机制

在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 • NH4+的导入不仅证明Glu是氮素同化发酵，而且它还会抑制 Glu生成的逆反应，因此当NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度很快， Glu的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎不影响糖代谢。

Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使Glu得以积累。 • 生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。 • 这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。

谷氨酸高产菌模型特征 • 丧失或有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化脱羧生成琥珀酰CoA和琥珀酸（琥珀酸延胡索酸苹果酸草酰乙酸）； • CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环； • 谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻； • 有过量的NH4+ 存在，-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外； • 同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。

核苷酸 • 代谢调控机制一、核苷酸的生物合成途径 1. 嘌呤核苷酸的全合成途径（“从无到有”途径） IMP－肌苷酸（次黄嘌呤核苷一磷酸） SAICAR 5-氨基-(N-琥珀基)代氨甲酰咪唑核苷酸 AMP－腺苷酸（腺嘌呤核苷一磷酸） GMP 鸟苷酸 AICAR 5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸 XMP 黄苷酸（黄嘌呤核苷一磷酸） PRPP 磷酸核糖焦磷酸 SAMP 腺苷琥珀酸 PRA 5-磷酸核糖胺

嘌呤核苷酸的全合成途径(1) —— 5' -IMP的生成（“从无到有”）

嘌呤核苷酸的全合成途径(2) —— AMP和GMP的互变（枯草芽孢杆菌）

各种微生物合成 IMP 的途径是一样的，但是从IMP分别生成 AMP和GMP的途径是不同的。 • 从IMP开始， • 枯草杆菌以IMP为中心分出两条环形路线，由此AMP与GMP可以互相转换； • 产黄短杆菌分出的两条路线不是环形，而是单项分支的，AMP与GMP不能互相转换。

模块七 典型产品