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项目三

项目三. 培养基配制技术. 教学目标. 教学终极目标. 会配制 MS 固体培养基. 促 成 目 标. 能按照培养基配方熟练进行化学药品称量和 试剂配制　 会使用高压灭菌锅灭菌 会阐述培养基配方成分在组培中的作用. 项目介绍. 培养基 （ Medium ）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的 培养基 还含有抗菌素和色素。 按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的，称为天然 培养基 ；

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  1. 项目三 培养基配制技术

  2. 教学目标 教学终极目标 • 会配制MS固体培养基 促 成 目 标 • 能按照培养基配方熟练进行化学药品称量和 试剂配制　 • 会使用高压灭菌锅灭菌 • 会阐述培养基配方成分在组培中的作用

  3. 项目介绍 培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。 按所用原料不同，可分为两类：应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的，称为天然培养基； 应用化学药品配成并标明成分的，称为合成培养基或综合培养基。

  4. 配制MS培养基母液。 任务1 配制MS固体培养基并灭菌。 任务2 工作任务

  5. 任务一 MS培养基母液配制 一、母液种类 母液：将所用培养基配方的化学成分按一定的比例配成浓缩液。 营养元素母液 大量元素母液 微量元素母液 铁盐母液 激素母液

  6. 二、母液的配制 1、大量元素 原则上可以混在一起，但硫酸镁与氯化钙要单独配制，因为高浓度的Ca2+与Mg2+与磷酸盐混合，会产生不溶性沉淀。 配制方法：用天平称取药品，分别加入600-700ml蒸馏水中，再用磁力搅拌器搅拌，待第一种药品溶解，加入第二种药品，最后定溶。或每一种药品分别溶解，然后混合，最后定溶。

  7. 2、微量元素 用分析天平准确称取药品，分别溶解，依次混合，最后定溶。有时KI单独配制。 3、铁盐母液 易沉淀，需单独配制，一般配成硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）与乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)的铁盐螯合剂。 用少量蒸馏水将Na2-EDTA加热溶解后，再缓缓倒入FeSO4溶液充分搅拌并加热5分钟，使其充分螯合。 4、有机物母液 分别称取药品，溶解，混合后加水定容。

  8. 5、激素母液 必需单独配制，储存于冰箱。 一般浓度为0.5-1mg/ml。 IAA、NAA、IBA、2，4-D等，可先用0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，然后定溶。 KT、BA等细胞分裂素应先溶于少量0.1mol/L的HCl，然后定溶。

  9. ＭＳ培养基母液的配制

  10. （1）大量元素母液（10X）：称10升量溶解在1升水中。配1升培养基取100ml。（1）大量元素母液（10X）：称10升量溶解在1升水中。配1升培养基取100ml。

  11. （2）微量元素母液（100X）：称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml（2）微量元素母液（100X）：称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml

  12. 组成 MS或B5（改良） mg/L mg/10.L Na2•EDTA 37.3 373 FeSO4•7H2O 27.8 278 （3）铁盐母液（100X）：称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml。 将上述两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA（乙二胺四乙酸二钠）较难溶解完全，急需时可适量加热，当两者均充分溶解完全后，先取一种置容量瓶中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液为好，最后定容。

  13. （4）维生素母液（100X）：称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml（4）维生素母液（100X）：称10升量溶解在100ml水中。配1升培养基取10ml

  14. 配制母液注意几点： • 配制倍数不宜过高，可避免浪费；也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。 • 母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。 • 母液贮备时间不宜过长。过长时宜出现沉淀和微生物污染。

  15. 任务二、MS培养基的配制与灭菌 一、MS培养基的配制 配制方法： 1、将母液按顺序摆放 2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的2/3)入容器 3、按需要量依次取母液（吸取量=配制浓度 × 体积 / 母液浓度）及生长调节物质 4、加入蔗糖(30g/L)溶解 5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min 6、定容 7、调PH值(pH=5.8) 8、分装培养瓶，封口 9、高压灭菌

  16. 糖 ③ 适量水 琼脂加热溶解定容 调pH值分装灭菌 ④ ⑤ ① ② 母液 湿热灭菌 辐射灭菌 过滤灭菌 ⑥ ⑦ 配制流程

  17. 二、培养基的灭菌 湿热灭菌法 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

  18. 过滤灭（除）菌（不耐热的物质 ） 一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。 防细菌滤膜网孔的直径为0.45μm以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。

  19. 实践操作 一、配制MS培养基母液 二、配制MS固体培养基并灭菌

  20. 问题探究 一、培养基成分： 1、无机营养：大量元素 微量元素 铁盐 2、有机营养成分：有机附加物 氨基酸 维生素 肌醇 糖类 3、植物生长调节物质： 生长素 细胞分裂素等

  21. 4、琼脂 5、活性炭 6、pH 7、水 椰乳（CM） 8、天然物质： 酵母提取物（ME） 麦芽提取物（YE）

  22. 1、无机营养元素(inorganic element) 1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。 [C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca]。 大量元素占植物体干重的百分之几十至万分之几的分量。 N分硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+），不同离体组织所需 的含量不一致，单独使用易导致培养基酸碱性漂移两者要保持 适当比例。 2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。 铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、硼（B）、碘（I）、钴（Co）、氯（Cl）、钠（Na）等 Fe：易形成絮状沉淀，常以Fe ·EDTA 的形式提供。 FeSO4 ·7H2O＋Na2 ·EDTA 两类元素虽然在培养基中含量差距很大， 但都是不可少的营养成份。含量不足就造成缺素症。

  23. 2、有机化合物(organic compound) （1）碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖也有所应用。 使用浓度在1%—5%，常用3% 在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 糖类作用：在组织培养中用作离体组织生长的碳源，维持培养基一定的渗透压。 培养效果有差异：葡萄糖＞果糖=蔗糖＞麦芽糖

  24. （2）维生素(vitamin) 在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动对离体组织的生长具有明显的促进作用，主要为B族维生素 。 种类： VBl(盐酸硫胺素)、 VB3（泛酸）、 VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸) Vc（抗坏血酸）、 VH(生物素) VB11(叶酸)、 VB12（钴胺素)等。 使用浓度： 一般用量为0.1-1.0mg／L。 。 Vc具有很强的还原能力，常用于防止组织褐变。

  25. （3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

  26. （4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 使用浓度：为10-200mg／L。

  27. 当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作用是促进细胞生长。如：当有机氮为唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在无机氮存在的条件下，才能取得理想的效果，它的主要作用是促进细胞生长。如： 酪蛋白水解物和胰蛋白水解产生的胨能增进国兰类组织的生 长，300mg/L谷氨酰胺也能起到同样的作用， 精氨酸对卡特兰、万代兰未成熟的种子有刺激其生长的作用 天门冬酰胺有促进国兰类籽苗生长的作用

  28. 10%—20% 150-200ml／L 150—200g／L 0.01%-0.05% 0.01%-0. 5% 3、有机附加物 （天然复合物） 成分不固定，主要有效成份大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 作用：它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 浓度 如: 在组织培养蝴蝶兰时，常加入香蕉泥或椰乳，可明显促进 原球茎发育成完整植株并加速小苗的生长。

  29. 4、植物生长调节物质(hormone) 植物生长调节物质是一些对植物生长发育及生理活动有特殊作用的生理活性物质。 这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用，有些可以刺激植物生长，而有些抑制植物生长。 在组织培养中，植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、器官分化的植株再生具有重要的作用。

  30. 主要包括： 生长素类(auxin) 细胞分裂素类 ( cytokinin ) 赤霉素（gibberellic acid）

  31. （1）生长素类 组培中的作用：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞伸长生长和促进生根。 概念：指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物，主要生理作用是促进细胞的纵向伸长，生长素包括内源的（存在于植物体内的）和人工合成的。 • 用量：mg/L级，mg/L=ppm • 用法：溶于95％乙醇或0.1mol/L NaOH

  32. 生长素的作用具有两重性： 既促进生长，又能抑制生长、甚至杀死植物； 既促进发芽，又会抑制发芽； 既能防止落花落果，又可疏花疏果。 这取决于浓度、细胞的年龄和器官的种类。 一般低浓度促进生长，中浓度抑制生长，高浓度则杀死植物。 在细胞年龄上幼年细胞比成熟细胞敏感。

  33. 生长素的应用 • 组培中的作用： • 诱导愈伤组织的产生， • 促进细胞脱分化 • 组织培养促进细胞伸长 • 促进生根 农业生产中的作用： • 插枝生根 • 防止器官脱落 • 诱导菠萝开花 • 促进果实形成

  34. 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度 下，(10-5-10-8mg/L)就可促进生长，其次是茎和芽。

  35. 生长素种类： 吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyri acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等 NAA、IBA→生根培养 2,4-D →愈伤组织诱导与增殖

  36. 生长素作用强弱顺序： 2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸) 强 NAA(萘乙酸) IBA(吲哚丁酸) IAA(吲哚乙酸) 弱

  37. （2）细胞分裂素类 概念：是一类具有促进细胞分裂和其他生理功能的物质总称。都为腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存在，特别是茎尖、根尖、未成熟的种子和生长着的果实等进行着细胞分裂的器官。 细胞分裂素作用： ①促进细胞分裂与扩大。 ②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。 ③抑制根的分化。 用量：mg/L级 用法：溶于0.5mol/L 稀HCl或稀NaOH，通常多用 NaOH助溶。

  38. 生理作用和应用： 1）促进细胞分裂和扩大 在组织培养中，当培养基缺少细胞分裂素时，细胞很少分裂、生长，加入细胞分裂素后，细胞就进行分裂，组织增大，产生愈伤组织。细胞分裂素可以使细胞横向扩大而不是伸长。 在生产中可以对绿肥、叶用蔬菜等叶用作物施用一些细胞分裂素，能够增产。

  39. 2）延迟衰老和保鲜 作用原理：阻止核酸酶和蛋白酶等水解酶的产生；阻止营养物质向外流动并使其向细胞分裂素所在的部位运输，促进物质的积累。 在生产上可以用于防止贮藏蔬菜的变质，延长贮藏时间。

  40. 3）诱导芽的分化 在愈伤组织的分化培养中，产生根或芽，取决于生长素 与细胞分裂素浓度的比值。 例如，在烟草愈伤组织培养时，当激动素：生长素为 0.02：2mg/L时，能诱导根的分化；两者比值为0.2： 2mg/L时，愈伤组织只生长不分化；当激动素的比例提 高到0.5：2mg/L时，能诱导芽的分化。

  41. 4）其他 促进侧芽发育，防止果树生理落果， 可打破种子的休眠，促使其发芽。

  42. 常用种类： 6-BA(6-苄基腺嘌呤) Kt (kinetin 激动素) Zt (zeatin 玉米素)

  43. 细胞分裂素作用强弱顺序 强 Zt (玉米素) 6-BA(6-苄基腺嘌呤) Kt ( 激动素) 弱

  44. （3）赤霉素 GA3（赤霉素）：最初从赤霉菌中提取到，能够引起水稻 等植株徒长。在组织培养中有时使用，如用于匍匐茎的诱 导。 作用：通过调节生长素的含量实现促进细胞伸长的。促进 幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株打破休眠。多用 GA3。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当 生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有 利于韧皮部分化。 用量：mg/L级 用法：易溶于水、乙醇，多用95％乙醇溶解储存。

  45. 另外： 脱落酸（ABA） →因物种不同，能促进或抑制愈伤组织生长； 乙烯（Eth） →有催熟作用，大量积累易影响生长、分化，导致培养物早衰、落叶和玻璃化苗，应尽量排除之； （BR）→可能与CYT有类似作用，有待研究。

  46. 紫罗兰组织培养 选择适合植株增殖的生长培养基，外植体表面长满绿色幼苗和并长出很多小根。

  47. 糖对紫罗兰组培的影响 Sucrose to 5% No sucrose (0%) Sucrose to 1% 外植体发生很少的幼苗，不产生根和愈伤组织 外植体表面产生幼苗，并产生少量的根。 外植体表面产生很多幼苗，同时幼苗基部产出很多根，原因是培养基中加入适合的控制物质。

  48. 细胞分裂素- BA对紫罗兰组培的影响 No BA BA reduced to 0.1 mg. l-1 A：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（定量） B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（定量）

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