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酵母表达系统. 优点 1 属于真核生物 , 可进行翻译后修饰 , 如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速. 酵母细胞结构. 两种酵母表达系统. 毕赤酵母 Pichia pastoris 现在多用. 酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae 过去常用. Pichia pastoris 表达系统. Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母 , 可以用甲醇作为唯一的碳源 . 易操作 , 培养容易 表达量高 , 可达培养液中 10 g/L 可以有真核生物的翻译后修饰 , 如糖基化 避免了酿酒酵母的过糖基化问题.
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酵母表达系统 优点 1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速
两种酵母表达系统 毕赤酵母 Pichia pastoris 现在多用 酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae 过去常用
Pichia pastoris表达系统 • Pichia pastoris是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源. • 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 • 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
胞外表达载体 1. Pichia pastoris 的表达载体 胞内表达载体 P. pastoris没有稳定的附加体质粒,所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子 AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达 AOX2 利用甲醇的能力低 生长慢
histidinol dehydrogenase gene (his4) 宿主His4突变,不能合成组氨酸, 在His缺陷培养基上不能生长; 质粒上有His4, 可合成组氨酸, 用His缺陷平板筛选转化菌株。
3. 多拷贝产生,pIC9K, 体内形成多拷贝 因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低 未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
BamH I:GGATCC CCTAGG Bgl II:AGATCT TCTAGA
4.宿主细胞Pichia Strain 基因型 GS115 AOX1正常,Mul+ KM71 AOX1被破坏, MulS 宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长 本身的回复突变为1/108。
转化后细胞的甲醇利用能力 GS115 KM71 AOX1正常,Mul+ AOX1被破坏, MulS 转化后对甲醇的利用 甲醇高利用 Sal I 、 Stu I切 甲醇低利用 Bgl II切 KM71无论在那里交换,只能是甲醇低利用,因为宿主没有AOX1 GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上交换的位置是否破坏宿主的AOX1
质粒线性化后转化宿主细胞 线性化位点 线性化质粒发生同源 重组的几率提高
pAO815和pPIC9K 在Sal I 、Stu I 单切, 在his 4插入(单交换),不破坏宿主的AOX1,转化GS115后产生: His +/Mut+ 单交换 同源重组基因转移法 :是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换原有基因片段。
5 AOX1 Bgl II His4 pAO815和pPIC9K 在Bgl II双切: 在5AOX1位点和3AOX1双交换,替换掉了宿主的AOX1基因, 转化后GS115产生 His +/Muts 3AOX1 His4 gene AOX1
技术路线 选择合适的内切酶位点 将基因插入载体 注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在大肠杆菌中操作 pAO815 体外构建多拷贝 线性化质粒 转化宿主细胞 组氨酸缺陷平板 筛选重组子
G418 筛选pIC9K 多拷贝 PCR检测 转化细胞中的基因插入 pAO815和pPIC9K 诱导表达 SDS-PAGE检测
酵母菌转化 PEG 1000 Transformation Method for Pichia Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine(N-二羟乙基甘氨酸 ), pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇) Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35 Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35 Filter sterilize and store at -20°C.
制备感受态细胞 1. 划线接种酵母菌,YPD平板, 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD,starting OD600 of 0.1 and grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞, 用50 ml of Buffer A洗细胞,室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中,分装成0.2 ml于灭菌的管中, 每管加 11 μl DMSO(-70度) ,混匀,液氮快速冷冻, -70°C保存。
保持感受态细胞在冰冻状态作转化! • Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. • It is critical to add DNA to frozen cell samples. • To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
Transformation • 1. 10-50 μg DNA(20 μl液体中), 直接加到 still-frozen tube of competent cells(40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA); 2. 37°C 水浴5分钟, 中间混匀两次; 3. 加 1.5 ml of Buffer B , 彻底混匀; 4. 30°C水浴1 hour; 5. 2000 x g 离心10 , RT, 去上清,细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C中; 6. 离心后将细胞悬浮在 0.2 ml Buffer C中; 7. 将细胞涂布在选择培养平板(MD)上, 30°C for 3 to 4 days.
储存液 10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) ,抽滤; 500X B (0.02% Biotin) ,抽滤; 10X D (20% Dextrose葡萄糖 ),抽滤; 10X M (5% Methanol), 抽滤; 10X GY (10% Glycerol),高压; 1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0, 高压。
YPD培养基 Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter) 1% yeast extract 2% peptone 900 ml of water Autoclave for 20 minutes on liquid cycle. 2% dextrose (glucose), (20%储存液,抽滤灭菌)。 Note: Add 20 g of agar if making YPD plates。
Minimal Dextrose MD平板 成分:1.34% YNB(yeast nitrogen base,酵母培养基) 4 x 10-5 % biotin 2% dextrose 配制方法: 1. 800 ml 水, (平板加15 g agar),灭菌 20 ; 2. 冷却到 60°C , 加100 ml of 10 X YNB,2 ml of 500 X biotin,100 ml of 10 X dextrose; 3. 倒平板。
BMGY: Buffered Glycerol-complex MediumBMMY: Buffered Methanol-complex Medium (1 liter) 成分:1% yeast extract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YNB 4 x 10-5% biotin 1% glycerol ( BMGY)or 0.5% methanol( BMMY)
毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点: 1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。 2. 操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价,且表达水平更高。 3.同为酵母,毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点,且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
毕赤酵母系统的注意事项 • 严格无菌操作,防止污染;可以镜检 • 温度≤30C; • 转化 • PCR检测 5. 诱导时间
酵母蛋白糖基化 • 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型; • 然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度(平均每个支链8-14 个甘露糖残基)比酿酒酵母中的(50-150 个甘露糖残基)短得多,但比人的大; • 酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头,而毕赤酵母则没有。一般认为α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗原性有关,使得这些蛋白不适于治疗应用。
蛋白质糖基化 • 蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式 ; • 糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。
1、N-linked glycosylation • a sugar attach to the amino group of an asparagine(天冬氨酰). • sequence motif Asn-Xaa-Ser/Thr
2、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue. • no sequence motif defined
3、C-Mannosylation (甘露糖化) • sugar is linked to the protein through a carbon-carbon bond.
4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins.糖基磷脂酰肌醇锚 • binding to the plasma membrane