各種疾病的分子基礎

1. 各種疾病的分子基礎 • 單基因疾病的突變類型 • 單一鹼基的突變 • 單一鹼基的取代位置可能在 • 啟動子、剪接訊號（內含子改變了剪接點、表現子產生不該有的剪接點）、poly A訊號、表現子的錯義突變(missense)或無意義突變(nonsense)、終止密碼突變、起始密碼突變 • 任何一個鹼基都可能發生突變

2. 靜默的突變（silence mutation） • 某一核苷酸的突變並未造成胺基酸種類的改變 • 無意義的突變（nonsense mutation） • 某一核苷酸的突變，使得轉譯時的密碼由一可以轉譯成胺基酸的密碼變成轉譯的終止密碼時稱之 • 錯義突變(missense) • 某一核苷酸的突變，造成胺基酸序列的改變 • 開放讀取框架的位移突變（open reading frame shift mutation） • 三個一讀核苷酸的密碼子，發生讀取位置錯位一個或兩個鹼基，使之後所轉譯的胺基酸序列都是錯誤的

4. 黑人族群發病率1/500的鐮刀細胞貧血 • 隱性遺傳 • Beta-globin 上的glutamic acid (GAG)變成了valine (GTG) • 血紅素蛋白四聚體，低氧情況下形成不溶性 • 紅血球變形失去彈性 • 不能通過微血管 • 循環阻塞-引起內臟損傷 • 瘧疾流行區高達1/12，這可能是演化的結果 • 治療的契機…….

7. Previous studies have demonstrated that sickle cell disease (SCD) can be corrected in mouse models by transduction of hematopoietic stem cells with lentiviral vectors containing antisickling globin genes followed by transplantation of these cells into syngeneic recipients. Although self-inactivating (SIN) lentiviral vectors with or without insulator elements should provide a safe and effective treatment in humans, some concerns about insertional mutagenesis persist. An ideal correction would involve replacement of the sickle globin gene (βS) with a normal copy of the gene (βA). We recently derived embryonic stem (ES) cells from a novel knock-in mouse model of SCD and tested a protocol for correcting the sickle mutation by homologous recombination. In this paper, we demonstrate the replacement of the human βS-globin gene with a human βA-globin gene and the derivation of mice from these cells. The animals produce high levels of normal human hemoglobin (HbA) and the pathology associated with SCD is corrected. Hematologic values are restored to normal levels and organ pathology is ameliorated. These experiments provide a foundation for similar studies in human ES cells derived from sickle cell patients. Although efficient methods for production of human ES cells by somatic nuclear transfer must be developed, the data in this paper demonstrate that sickle cell disease can be corrected without the risk of insertional mutagenesis.

8. 突變熱點hot spot • 較常出現的取代為C → T (CpG →TpG) • 因甲基化的5mC去氨反應，形成T • 男生機率較高（因精子DNA高度甲基化） • 1/3凝血因子8號的血友病患也發生在CpG雙鹼基上 • G6PD（glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency ）蠶豆症 • 存於人體紅血球內，協助葡萄糖進行新陳代謝之酵素。G6PD缺乏時，若身體接觸到具氧化性的特定物質或服用了這類藥物，紅血球就容易被破壞而發生急性溶血反應 • 台灣地區發生率為３％，客家人發生率較高 • 屬性聯遺傳疾病，故男性患者多於女性患者

9. 內含子intro：一般較能容忍突變而沒有明顯影響內含子intro：一般較能容忍突變而沒有明顯影響 • 果蠅與mRMA剪接的突變會造成疾病的發生 • 缺失、插入、重複 • 少數幾個鹼基 • 大片段的鹼基 • a地中海貧血：同源序列的錯配和不等互換 • 減數分裂I期，同源染色體互換時，相鄰的一段重複序列發生錯配，使互換發生不相等交換，造成缺失與重複 • b地中海貧血的b球蛋白基因群不等交換 • bd球蛋白基因的融合 • 白血病中的費城染色體 • 22號染色體BCR基因3端與9號染色體ABL 5端融合

10. 參考資料：www.scinfo.org/hemoglb.htm

13. 倒位 • 凝血因子8號的5端有兩個反向重複序列，若此序列發生互換，使其序列顛倒，基因會失去功能 • 三鹼基的不穩定突變 • 數量的變異會引起某些遺傳疾病 • 杭丁頓舞蹈症 • 因為Huntingtin蛋白末端三個鹼基CAG重複所造成 • 正常重複次數10-30 • 發病36-121 • 次數重複越多越早發病

14. 脆性X綜合症(fragile X syndrome) • X連鎖遺傳性智能低下症 • 特殊外表，90％青春期巨睪，輕度結締組織異常 • FMR1 (fragile X mental retardation-1) • Xq27.3末端功能未知基因 • 38 kb中含17個exon • 第一個exon的非轉譯區有CGG重複序列，正常重複6-50次 • 發病個體重複數百到數千次 • 重複大於230次，基因5端高度甲基化，不表現

15. 可發生在exon轉譯與非轉譯區，或是intro中

18. 杭丁頓舞蹈症 脊髓性小腦萎縮症 小腦萎縮症第三型 一種神經退化疾病 脊髓延髓肌肉萎縮症 萎縮性肌強直症 佛萊德雷運動失調症

19. http://www.tfrd.org.tw/cindex.php

20. 罕見疾病基金會網站對罕見疾病的分類

21. 大部分的突變都沒有明顯的表現型，因同源染色體上還有一套正常的基因大部分的突變都沒有明顯的表現型，因同源染色體上還有一套正常的基因 • DNA的多型性DNA polymorphisms遺傳標記的基礎 • RFLP限制片段長度多型性 • RFLP, restriction fragment length polymorphism • DNA序列的變化，造成限制酶切點的改變 • 突變點造成限制酶切點破壞或增加，造成切出的DNA長短不同，出現了長度的多形性 • VNTR相連重複序列可變數目 • variable number of tandem repeats • 一小段DNA前後重複多次，不同個體間某染色體上所具重複次數不同具有多型性 • Probe 可設計於VNTR外或內部。外部較常用 • 散佈於基因組中，限制了其方便性

22. 短相連重複序列( STR ， short tandem repeats ) • 微衛星多型性(microsatellite polymorphism) • 基因體中1 ~ 4 （2 ~ 8) 鹼基短序列重複單位，稱為微衛星 • 基因體內有很多不同區具有STR，可以利用PCR技術作進一步的分析 • 量化基因體內某一區的STR，然後跑gel後可決定重複次數 • 親子鑑定時通常檢查13處的STR基因位(可擴增至25) • 這些基因位為美國聯邦調查局為防治犯罪，建立資料庫時所使用的，亦稱為CODIS [Combined DNA Index System]基因位 • Y-STR 單倍型分析

24. 連鎖分析linkage analysis：DNA多型性的應用 • 研究染色體上未知基因，藉由相鄰的基因來定位 • 如RFLP的遺傳，若某致病基因與特定RFLP緊密連鎖，就可利用此RFLP當作標記來判讀 • 同源染色體的交換可能會影響到標記正確性 • 影響連鎖分析的因素 • 基因在染色體上的位置已知，但未被選殖定序 • 基因已知但突變位置變化大，在家族中有特異的對偶基因 • 家族中稀少的對偶基因

25. 需有血緣關係容易做，家族樣本大。例如：冰島全民基因庫……需有血緣關係容易做，家族樣本大。例如：冰島全民基因庫…… • 有些疾病是多基因和環境交互作用的結果 • 單基因疾病 • 遺傳標記＋致病基因連鎖分析，縮短基因搜尋範圍 • 多基因疾病 • 研究純合子(同型合子)homozygote的遺傳 • 阿滋海默症、氣喘、高血壓、動脈粥狀硬化、腫瘤……

27. 分子診斷技術簡介 • DNA質與量上的偵測 • 質的偵測：DNA序列上的突變或差異 • 量的偵測：基因的表現 • mRNA量的變化 • 基因的副本數copy number • 中心方法 • 核酸分子雜交 • 聚合酶鏈鎖反應PCR

28. 限制酶restriction enzyme • 原核生物所產生 • 保護原核生物免於外來DNA感染 • 1970 Johns Hopkins Hamiton Smith所分離 • 辨識DNA上特定的核苷酸序列 • 雙股DNA 4-8個核苷酸 • 雙股序列相同，方向相反， 稱迴文序列palindromic sequence • 命名法：Hind III（Haemophilus infuenzae） • 第一個字母細菌的屬名genus • 第二、三字母細菌的種名species • 第四個字母細菌的strain • 羅馬數字為發現的順序

29. 限制酶因切割位置不一樣有三種缺口 • 切出5’端突出的黏端5’-cohesive (sticky end) • 切出3’端突出的黏端3’-cohesive (Sac I) • 切出鈍端blunt-end

31. 核酸分子雜交 cDNA基因庫（文庫） 抽取mRNA，再反轉錄成cDNA (互補DNA, complementary DNA)，把cDNA複製成雙股的DNA，再將DNA選殖到載體系統 來自mRNA，為細胞中『當時』能表達的基因 都是編碼序列，不含內含子或重複序列 基因庫中的序列片段為隨機，需要多少DNA片段才能涵蓋整個基因組？

32. 篩到基因的機率 公式：N = ln (1 -P) / ln (1 –F/T) N所需篩選的重組clone數目 P篩到基因的期望值(0.99) F單一個重組DNA的平均片段大小 (20 kb) T基因組大小(3 X 109 bp) N = ln (1-0.99) / ln (1 – 20/3000000) = ln 0.01 / ln 0.999993333 = -4.6 / - 0.000006 = 690773

33. 篩到基因的機率（原核生物為例） 公式：N = ln (1 -P) / ln (1 –F/T) N所需篩選的重組clone數目 P篩到基因的期望值(0.99) F單一個重組DNA的平均片段大小 (5 kb) T基因組大小(5000 kb) N = ln (1-0.99) / ln (1 – 5/5000) = ln 0.01 / ln 0.999 = -4.6 / - 0.001 = 4600

34. 南方墨點轉印法Southern blotting • 1975 Edwin Southern發明 • 利用鹼基互補的原則

35. 北方墨點轉印法Northern blotting • 1977 Alwine修改southern blotting發展出來 • 也是利用DNA-RNA互補的原則

36. 西方墨點法Western blotting • 免疫墨點法 • 偵測分子：蛋白質 • 跑SDS-PAGE（分離蛋白質）→轉漬到纖維膜→加一次抗體→加二次抗體→呈色 SDS-PAGE 參考資料：http://www.evidenttech.com

37. 聚合酶鏈鎖反應(PCR, polymerase chain reaction) • 在試管內快速且大量複製DNA的技術 • 1970 Khorana等人提出其理論 • DNA尚不能定序 • 寡核苷酸合成不易 • 1983 Kary Mullis等人提出實際操作方法 • 獲得1993年諾貝爾化學獎

38. 變性(Denaturation) • 加熱（95℃）將模版DNA雙股分開 • 引子黏合(primer annealing) • 降低溫度使特異性引子黏合至單股模版DNA的互補序列 （溫度40 ～ 72℃） • 延展(extension) • DNA聚合酶開始合成新股DNA （最佳反應溫度72℃） • 此三步驟為一個循環，一般進行25 ～30個循環