大肠杆菌 Ⅰ 型菌毛基因的克隆 ﹑ 表达及呈现表达载体的构建（部分内容）

大肠杆菌Ⅰ型菌毛基因的 克隆﹑表达及呈现表达载体的构建（部分内容）学生：王国相导师：戴鼎震秦爱建

Ⅰ型菌毛基因结构图 Length regulator • B E A I C D F G H Export Minor subunits Regulation Major subunit Usher Number regulator Adhesin Chaperone P1 P2 P8 P9 P3 P4 P6 P7 P5 引物P1,P2扩增片段BEA 引物P3,P4扩增片段IC 引物P5,P6扩增片段D 引物P5,P7扩增片段D’ 引物P8,P9扩增片段FGH 引物P5,P9用于SOE PCR，扩增片段DFGH

Ⅰ型菌毛呈现表达载体结构模式图 C A B A, Fimbriated E.coli. B,C, Model for high- and low-valency display of heterologous By type Ⅰfimbriae . Black knobs represent the passenger epitopes.

片段BEA PCR扩增图 1 2 3 23130 9416 6557 4361 3300 2320 2027 1，3 片段BEA PCR产物 2 分子量标准λHindⅢ digest

片段IC,D PCR扩增 1 2 3 23130 9416 6557 4361 2320 2027 1 分子量标准λHindⅢ digest 2 片段IC PCR扩增产物约2050bp 3 片段D PCR扩增产物约2150bp

片段D’ ，FGH PCR扩增 1 2 3 23130 9416 6557 4361 2320 2027 1 分子量标准λHindⅢ digest 2 片段D’ PCR扩增产物约2200bp 3 片段FGH PCR扩增产物约2300bp

SOE PCR 扩增片段DFGH 1 2 bp 5000 4000 3000 2000 1000 1片段DFGH PCR扩增产物约4300bp 2 1Kbp DNA Landder

质粒pBEA的构建 fimB fimE fimA Kpn1 EcoR1 EcoR1+Kpn1双酶切

质粒pBEA酶切鉴定 • 1 2 3 4 5 23130 9416 6557 6000 4361 3300 2670 2322 2027 1,2为pBEA EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切图 3,4为pBEA EcoRⅠ单酶切图 5为λ-HindⅢ digest marker

片段IC，D的T/A克隆 1 2 3 1 2 3 4 bp 23130 9416 6557 4361 2320 2027 bp 6000 5000 4000 3000 2000 1000 1 1Kbp DNA Landder 2,3 D T/A克隆BamH1+Sal1双酶切 1 分子量标准λHindⅢ digest 2,3,4 IC T/A 克隆Kpn1+BamH1双酶切

质粒pBC的构建 Kpn1+BamH1双酶切

质粒pBD的构建 BamH1+Sal1双酶切

质粒pBC,pBD酶切鉴定 • 1 2 3 4 5 10200 8000 8000 6100 2100 1900 1，pBC BamHⅠ单酶切 2，pBC BamHⅠ+KpnⅠ双酶切 3， λ-HindⅢ digest marker 4， pBD BamHⅠ单酶切 5， pBD BamHⅠ+SalⅠ双酶切

pBH的构建 BamH1 fimD fimF fimG fimH Sal1 BamH1+Sal1双酶切

pBH酶切鉴定 1 2 4 bp 23130 9416 6557 4361 2320 2027 bp 12400 8000 4300 1 分子量标准λHindⅢ digest 2 pBH BamH1+Sal1双酶切 3 pBH Sal1单酶切

SDS-PAGE电泳 1 2 3 4 5 97.2 66.4 44.3 1 TK3(阳性对照） 2 HB101+pUC18（阴性对照） 3 HB101+pBD 4 HB101+pBH 5 Protein Molecular Weight Marker (Low) 29.0 20.1 17.5

大肠杆菌 Ⅰ 型菌毛基因的 克隆 ﹑ 表达及呈现表达载体的构建 （部分内容）