第三节 基因重组和杂交育种

1. 第三节 基因重组和杂交育种 • 基因重组（gene recombination）是指两个独立基因组内的遗传基因通过一定途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基因组的过程。也称为遗传重组（genetic recombination ）。 • 杂交育种（hybridization）是将两个或多个品种的优良性状集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。育种时有目的地将具有不同优良性状的两个亲本进行杂交，使两个亲本的优良性状结合在一起，培育出同时具备两种优良性状的新品种。

2. 重组与杂交的关系 （1）重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交；而一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。 （2）杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。 （3）真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexual hybridization）等及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反应。

3. 微生物中各种形式基因重组的比较

4. 一、原核生物的基因重组 基因重组的方式 • 转化(transformation) • 转导(transduction) • 接合(conjugation, mating) • 原生质体融合(protoplast fusion)

5. （一）转化（transformation） 1、概述 • 定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体 菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。 • 有关名词： • 受体菌(recipient/receptor) :转化基因的接受者 • 供体菌(donor):转化基因的提供者 • 转化因子(transforming principle):来自供体菌的DNA片段 • 转化子(transformant):转化后的受体菌

6. 2、感 受 态 • 出现时间只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。 • Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期； • Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。 • 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同。 • Bacillus subtilis不超过10~15% • Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100%

7. 3、转化因子 本质：离体的DNA片段，一般的转化因子都是线状双链 DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。 大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。 吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。 转化频率：一般只有0.1~1%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）。

8. 4、转化过程 发生条件 • ①受体细胞要处于感受态 • 感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态； • ②供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1× 107D左右 ； • ③菌株间的亲缘关系密切。

9. 转化过程示意图 dsDNA 供体(strR) 感受态受体(strS) 酶解与吸收单链 同源区段配对 单链整合 复制与分离 转化子(strR) 非转化子(strS)

10. 5.转染（transfection） • 定义： • 把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染(transfection)。 • 与转化的区别： • 病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌； • 中间不发生任何遗传因子的交换或整合； • 最后不产生具有杂种性质的转化子。

11. 完全普遍转导 普遍转导 流产普遍转导 转导 低频转导 局限转导 高频转导 （二）转导（transduction） 定义：以缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新遗传性状的重组细胞，称转导子（transductant）。 转导的种类

12. 1 普遍转导（generalized transduction） 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组的任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的现象，称为普遍转导。 （1）完全普遍转导：complete transduction。 1952年发现，在Salmonella typhimurium中存在转导现象。在它的完全普遍性转导实验中： • 以其野生型菌株作为供体菌 • 营养缺陷型菌株作为受体菌 • P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体

13. 由P22噬菌体引起的完全普遍转导过程示意 （1）P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10-6 ~10-8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的完全缺陷噬菌体。

14. （2）供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i ，multiplicity of infection ）<1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。

15. （3）导入的外源DNA片段与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而整合到受体菌染色体组中，致使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。（3）导入的外源DNA片段与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而整合到受体菌染色体组中，致使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。 一个稳定的转导子的形成 1第一次交换 2第二次交换 3交换完成，外源DNA掺入染色体组中

16. （2）流产普遍性转导（abortive transduction） 概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。 现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释。 能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。

17. 2. 局限转导(specialized transduction) • 定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。 • 特点： 只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）； • 该特定基因由部分缺陷噬菌体携带； • 缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率（约10-5）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）； • 局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶原菌的诱导并引起裂解后才产生。 • 分类：低频转导与高频转导

18. 局限转导过程示意图

19. 2.1 低频转导（LFT，low frequency transduction） • 一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的(10– 4 ~ 10– 6)。把这种裂解物称为低频转导裂解物 （ LFT lysate） 。 • 用LFT裂解物以低 m. o. i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导子。 LFT lysate的形成

20. 2.2 高频转导（HFT，high frequency transduction） • 当用LFT裂解物以高m. o. i 感染E. coli gal–菌株时，凡是感染有λdgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的 λ噬菌体。这时λ 与λdgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌(double lysogen)。 • 当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常λ噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helper phage）。 • 双重溶源菌的裂解物中含有等量的λ和λdgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。

21. 高频转导和低频转导图解 E. coliK12 ()gal+(供体菌)  (大量) + dgal+（10-5） E. coli K12Sgal-(受体菌) E.coliK12Sgal-/  dgal+ E.coliK12Sgal-/  dgal+/  U.V. 低频转导 （双重溶源转导子） • E. coli K12Sgal-/  dgal+/ （双重溶源菌供体） • (50%) + dgal+（50%） • E. coli K12Sgal-(受体菌) E.coliK12Sgal-/  dgal+（转导子） U.V. 高频转导

22. 普遍性转导和局限性转导的比较

23. 3. 溶源转变 • 概念：当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌 体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫 性以外的新性状的现象，称为溶源转变。 • 性质：表面上与转导相似，而本质上不同于转导。 • 区别： • 当宿主丧失其原噬菌体时，通过溶源转变而获得的新性状 也随之消失 • 温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因，是噬菌体自身 基因使宿主获得新性状 • 温和噬菌体是完整的，不是缺陷的 • 获得新性状的是溶源化的宿主细胞，不是转导子

24. （三）接合（conjugation） • 定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”） 相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞 中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而 使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。 • 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子（conjugant）. • 研究方法：1946年J. Lederberg等采用E.coli的两株营养缺陷型进行实验，奠定了方法学基础；也为以后的微生物遗传学提供了必要的条件。

25. F+× F– F++ F– F因子的存在方式 根据F因子在E. coli中的有无，及与染色体的关系，可将E. coli分为四种类型： • ①F+（“雄性”）菌株 • 细胞内含有（1~4个）游离的F因子，细胞表面存在与F因子数目相当的性菌毛。 • 与F– 相接触时，可通过性菌毛将F因子转移到F– 细胞中，使之也变成F+菌株。 F因子以很高的频率传递，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般并不被转移。

26. ② F–（“雌性”）菌株 细胞中不含有F因子，细胞表面不具有有性纤毛。 可以通过与F+、F′或Hfr菌株接合而接受供体菌的F因子、 F′因子或Hfr菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成F+菌株、 F′菌株或重组子。

27. ③ 高频重组菌株（Hfr） • 含有与染色体特定位点整合的F因子。因该菌株与F–接合后的重组频率比F+菌株高几百倍而得名。 • Hfr菌株与F–菌株接合时，Hfr染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，F因子位于线状单链DNA的两端，整段单链线状染色体从5’端开始等速进入F–细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约120分钟。

28. ④ F′菌株 细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状F因子，可与F–菌株接合，使其成为F′菌株。 F′菌株的形成：由Hfr菌株中的F因子在不正常切离而脱离核染色体组时所形成，并因此造成细胞染色体发生缺失， F因子也缺失一段DNA. 由Hfr异常释放所生成的F′菌株，称为初生F′菌株； 由F– 接受外来F′因子所产生的F′叫作次生F′细胞。

29. F因子转导F-mediated transduction:利用F′菌株与F– 接合可将供体染色体DNA传入F–菌株，从而使F–既获得供体菌的若干遗传特性，又可获得F因子。这种接合方式叫做F因子转导，又称性导sexduction。 图 ：初生F′菌株和次生F′菌株的由来

30. F因子的存在方式

31. F因子之间相互关系

32. （四）原生质体融合——protoplast fusion • 概念： • 通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。 • 适用范围： • 各种生物细胞都能进行原生质体融合。 • 意义： • 70年代后发展的一种育种新技术，继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合不仅能在不同菌株或种间进行，还能做到属间、科间甚至更远缘的

33. 微生物或高等生物细胞间的融合。 • 发展点： • 有关原生质体融合的遗传机制，目前还在探索中。 • 原生质体融合的优点： • 可以提高重组率 • 双亲可以少带标记或不带标记 • 可进行多亲本融合 • 有利于不同种间、属间微生物的杂交 • 通过原生质体融合提高产量

34. 原生质体融合的主要步骤： • 选择亲株→→制备原生质体→→原生质体融合 →→原 生质体再生→→ 筛选优良性状的融合重组子 原生质体融合操作示意图

35. 二、真核微生物的基因重组 • 有性杂交 • 准性杂交 • 原生质体融合（略） • 转化（略）

36. （一）有性杂交 一般指不同遗传型的两性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。 酵母菌的有性杂交育种 亲本单倍化→有性杂交→杂交后代检出→优良性状个体筛选

37. 子囊孢子发芽 接合 自 或 然 人 破 工 壁 破 壁 减数分裂 S. Cerevisiae的双倍体和单倍体细胞的比较 项 目 双倍体 单倍体 细 胞 大，椭圆形 小，球形 菌 落 大，形态均一 小，形态变化较多 液体培养 繁殖快，细胞较分散 繁殖较慢，细胞常聚集成团 在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子 不形成子囊

38. （二）准性杂交（parasexual hybridization） • 定义和意义：类似于有性生殖但更原始的生殖方式，是通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。 • 为半知菌育种提供了一个重要手段。 • 存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中 • 准性生殖的过程：

39. Penicillum urticae 的准性杂交步骤

40. 准性杂交步骤： 选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本。 强制异合：将两菌亲株的分生孢子(106~107)混合涂[-]平板，并做单亲本对照， [-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体。 • 异核体：同一菌丝有不同遗传型的核。特点如下： • 具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体； • 具有野生型性状，可在基本培养基上生长 ； （基因互补功能） • 大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合二倍体（重组子）。

41. 移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面。移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面。 验稳定性：在[-]夹层平板上培养后，再倒上一层[+]，再培养后若出现大量新菌落，说明是不稳定的异核体，反之是杂合二倍体。 体细胞交换和单倍体化：杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离

42. A B （同核体） A+B （异核体） （杂合二倍体） AB A B A B A B 单倍体杂合子 A B （单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。诱变剂进行处理可促进单倍体化。 生产性能测定：筛选优良的准性杂交菌株。

43. 准性生殖过程示意图 ①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体 ④体细胞交换和单倍体化。

44. 准性生殖与有性生殖的比较 项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现，几率低 正常出现，几率高

45. 请 提 宝 贵 意 见 谢 谢