Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

1. Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012

2. 8. Группоспецифическая химическая модификация. Применение для исследования структуры и функции активных центров ферментов

3. Методы изучения структуры и функций биополимеров и активных центров ферментов • Рентгеноструктурный анализ (РСА) – основной на сегодняшний день метод исследования структуры ферментов, • Сайт-направленный мутагенез, • Химическая модификация и ее более специфический тип – аффинная модификация, • Методы, основанные на применении флуоресцентных и спиновых меток.

4. R R Подбор химических модифицирующих агентов 1. Высказывается предположение об аминокислотных остатках, находящихся в активном центре ферментаили интересующем сайте, 2. Осуществляется подбор реагентов, специфичных к определенным аминокислотам, 3. Исследуется ковалентное присоединение реагента к белку и стехиометрия присоединения, 4. Определяется уровень инактивации фермента, как следствие химического воздействия. Схема химической модификации. Х – модифицируемый остаток аминокислоты в активном центре, R – химический реагент.

5. Недостаток метода Y R R R R Y

6. После реакции модификации: • Входит ли модифицированный аминокислотный остаток в активный центр фермента? • Важен ли он для активности фермента?

7. После реакции модификации: Анализ образовавшихся продуктов Гидролиз с помощью протеаз Идентификация модифицированного остатка: (разделение полученной смеси пептидов с помощью электрофореза или хроматографических методов) Двумерный электрофорез: анализируемый пептид вырезали из геля и секвенировали по Эдману Масс-спектрометрический метод MALDI и его различные разновидности

8. Влияние рК функциональных групп биополимеров на их реакционную способность Изменение рК боковых радикалов аминокислотных остатков вследствие их окружения в составе белков является одним из главных факторов, определяющих их реакционную способность. Например, большинство аминокислот реагируют в непротонированной форме, а значения рК для фyнкциональных групп одинакового строения, в зависимости от их окружения в молекуле белка, могут отличаться на 2 единицы.

9. Модификация остатка серина протеаз, R=-СН2ОН Для модификации гистидина в активном центре протеаз: BrCH2C(O)NH2BrCH2COOHICH2COOH Br-ацетамид Br-уксусная кислота I-уксусная кислота При рН 6-7 модификации подвергался остаток Ser, хотя при таких значениях рН –ОН группы серина почти не гидролизуются. Cерин изначально проявляет слабую нуклеофильность. В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре нуклеофильность серина существенно повышается при помощи гистидина, оттягивающего на себя протон в паре Ser-His

10. Модификация остатка цистеина I-уксусная кислота

11. 1-фтор-2,4-динитробензол пиридоксаль-5’-фосфат Модификация остатка лизина

12. Модификация остатка аргининас помощью фенилглиоксаля

13. Модификация остатка тирозина N-бромсукцинимид

14. Модификация остатка гистидина диэтилпирокарбонат

15. Модификация биополимеров бифункциональными реагентами • Реагенты, содержащие две модифицирующие группировки, способны присоединяться к двум сближенным группам в составе одного белка или молекулы нуклеиновой кислоты или образовывать ковалентные связи с двумя молекулами биополимеров. • Расстояние между функциональными группами, подвергающимися модификации одной молекулой реагента, ограничено его длиной. Поэтому исследование модификации с помощью бифyнкциональных реагентов различной длины позволяет получить информацию о взаимном расположении различных функциональных групп в составе биополимеров, макромолекул в сложных комплексах (рибосомы, хроматин) или в клеточных структурах (например, белки в мембранах) или даже об организации ферментных комплексов внутри живой клетки.

16. Бифyнкциональные реагенты Гетерофункциональные содержат две реакционноспособные группы различной специфичности Содержат две одинаковые реакционноспособные группы Модификация осуществляется простой обработкой исследуемого биополимера или макромолекулярного комплекса с помощью реагента Модификация осуществляется последовательно Реагент может быть сначала присоединен к одной из макромолекул. Затем после помещения биополимера в какие-то новые условия проводится модификация второй функциональной группой

17. Примеры бифункциональных реагентов диимидоэфиры 1,5-дифтор-2,4-динитро-бензол

18. Пример гетерофункциональных реагентов Первоначально можно присоединить эти реагенты к определенным точкам в структуре белка за счет светонезависимых специфичных реакций. Затем может быть проведена активация азидогрyпп реагента. При этом будут происходить реакции в окрестности модифицированной аминогрyппы или SH –группы. Реагенты содержат азидогруппы и группы, специфично модифицирующие аминогруппы или SH-гpyппы

19. Расщепляемые бифyнкциональные реагенты Содержат между реакционноспособными группами специальную структуру, которая позволяет расщепить реагент на две части после проведения модификации. В качестве таких структур используют, например, дисульфидную связь, которая может быть разрушена окислением или восстановлением: Или цис-гликольную группировку, которую можно разрушить окислением перйодатом. При модификации диэпоксибутаном цис-гликольная группировка возникает в реакции: