1 / 44

Rekayasa Enzim dan Metagenom

Rekayasa Enzim dan Metagenom. Keanekaragaman Protein. Keanekaragaman hayati Rekayasa Protein. Pembuatan Mutan Directed Random Recombination. Rational Protein Design. Perubahan asam amino/urutan spesifik Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi

alana-fulton
Download Presentation

Rekayasa Enzim dan Metagenom

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Rekayasa Enzim dan Metagenom

  2. Keanekaragaman Protein • Keanekaragaman hayati • Rekayasa Protein

  3. Pembuatan Mutan • Directed • Random • Recombination

  4. Rational Protein Design • Perubahan asam amino/urutan spesifik • Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi • Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’

  5. Efficient & Rational Protein Design • Interdisiplin • Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik • Struktur 3-D protein • Computer modelling • Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur • Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related

  6. Directed • rational (site directed mutagenesis) G TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA

  7. Perbaikan Stabilitas Protein • Penambahan ikatan disulfida: • Lokasi sistein berdekatan pada struktur 3 D • Bukan merupakan pusat aktif • Tidak merubah struktur • Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi asparagin dan glutamin. • Penambahan ikatan hidrogen, jembatan garam, interaksi hidrofobik

  8. Varian • Streptokinase • WT • Lys386Gln • Lys59Gln • Lys386Gln, Lys59Gln • Mutasi menyebabkan protein menjadi tahan terhadap plasmid

  9. Random: Error prone PCR • Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase • Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ • Penurunan konsentrasi nukleotida • Peningkatan siklus PCR • Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb)

  10. Recombination: DNA shuffling • Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994 370, 389-91 • Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda • DNA induk dipotong dengan DNaseI • Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase

  11. Recombination Family shuffling • Extention of technique to homologous genes • Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble

  12. DNA Shuffling

  13. Recombination DNA shuffling Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation

  14. α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens • Temperatur optimum 50oC-70oC • pH optimum 6 • Likuifasi pati dan detergen • Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) • Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant • DNA shuffling: 10.000 klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. • Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)

  15. Lili Euwilaichtr

More Related