La ingeniería genética

1. La ingeniería genética

2. La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan: • La tecnología del ADN recombinante: Con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. • La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN (con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para determinado estudio. • La secuenciación del ADN: Que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

3. La tecnología del ADN recombinante • Se realiza mediante unas “herramientas moleculares”: • restrictasas (enzimas de restricción) • ligasas • Las enzimas de restricción son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos (actúan como “tijeras moleculares”). • Las ligasas pueden volver a pegar los extremos cortados procedentes de distintos orígenes (por ejemplo, de un virus y una célula). • El resultado es un ADN recombinante. • Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño en un ADN receptor. • Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular o la integración de un gen humano en el genoma de una bacteria. La célula que recibe el ADN recombinante se llama célula huésped o anfitriona. La célula anfitriona se multiplica y con ella el ADN recombinante con el gen integrado. Se obtiene un clon de células y con ello también un clon del mismo gen que contienen

4. Cómo actúan las enzimas de restricción Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las dos cadenas de ADN. En el punto cortado quedan los extremos libres que se llaman extremos pegajosos o cohesivos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. Se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción en ambas hebras. El resultado de la actuación de la enzima de restricción es queha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos “bordes pegajosos” o “cohesivos” por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente, que haya sido cortado con la misma enzima.

5. Acción de una enzima de restricción o restrictasa

6. En el siguiente modelo simplificado se “corta” un ADN de bacteria (en rojo) y se le “pega” un trozo de ADN humano (en amarillo) que ha sido cortado previamente con la misma enzima de restrcción

7. En general: El ADN cortado y extraído de un organismo (que contiene uno o más genes) puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. Por ejemplo: De manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria, que hace así el papel de célula anfitriona. Si es el gen que regula la fabricación de la proteína insulina, al ponérselo a una bacteria se "obliga" a ésta a que fabrique la insulina. Además, al dividirse la célula anfitriona, las nuevas células formadas contienen ese gen y también sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular (un clon) que contiene un genoma distinto del primitivo. Se dice que se ha realizado una clonación del gen.

8. El organismo obtenido por esta técnica recibe el nombre de: • Organismo recombinante, si es un virus o una bacteria, • Organismo transgénico, si es un ser pluricelular (animal, planta, etc.). En general se llama organismos transgénicos a los que se desarrollan a partir de una célula (puede ser el cigoto) en la que se han introducido fragmentos de ADN de otro individuo que se integran en su genoma y se expresan.

9. Etapas de la tecnología del ADN recombinante En la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar varias etapas: • Localización del fragmento del ADN en que se halla el gen que se quiere clonar. • Preparación de un vector que sirva de vehículo para el gen en cuestión (por ejemplo, un virus o un plásmido). • Fragmentación de ambos ADNs por enzimas de restricción. • Formación del ADN recombinante (entre ambos ADNs) por enzimas ligasas. • Introducción del vector con ADN recombinante en la célula anfitriona (huésped). • Propagación del cultivo celular por proliferación de la célula anfitriona. • Detección y selección de clones recombinantes de entre las células del cultivo.

10. Preparación de la secuencia del ADN en la que se halla el gen a clonar. Una vez aislado el ADN que se desea clonar se trata de cortar mediante la utilización de enzimas de restricción. en fragmentos específicos pequeños y manejables que contengan el gen de interés. Cada enzima reconoce una secuencia específica de entre cuatro y ocho pares de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las dos cadenas de la molécula de ADN Quedan los extremos libres (“extremos pegajosos” o “cohesivos”), que pueden unirse por complementariedad a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima.

12. Preparación de un vector que sirva de vehículo para el gen en cuestión. El vector será el vehículo portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos y virus de bacterias. El ADN del vector se somete al mismo procedimiento de fragmentación con la misma enzima de restricción, por lo que tendrá los mismos extremos cohesivos que el ADN a clonar.

13. Formación del ADN recombinante (unión entre ambos ADNs) Se trata de unir el ADN del vector y el ADN que se va a clonar mediante los extremos cohesivos, para lo que se requiere la intervención de enzimas ADN-ligasas. Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se le suele llamar ADN inserto, o simplemente, inserto.

14. Recombinación de dos moléculas de ADN de distinto origen Una molécula de ADN de un origen (ADN-1) puede unirse por sus “bordes pegajosos” a una de otro ADN (ADN-2) aunque sea de una especie diferente. • ADN recombinante: corte y empalme de ADN (Animación) • Se tienen dos trozos de ADN de dos especies distintas: especie A de color rojo y especie B de color azul. • Se rompen las hebras con una enzima de restricción. • Después se pueden unir las hebras de las dos especies.

15. Introducción del vector con ADN recombinante en la célula anfitriona Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona ohuésped Los tipos de células anfitrionas más utilizadas son: Células bacterianas. Son las más usadas, ya que tienen alta velocidad de replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables. Células eucarioticas. Aunque son, en general, difíciles de mantener se usan: Levaduras: útiles en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucarioticas. Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables. No todas las células consiguen incorporar el vector con el ADN recombinante, Por ello se debe introducir además algún tipo de marcador asociado al ADN recombinante que permita después distinguir qué células anfitrionas lo contienen. Por ejemplo, si el plásmido contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico, después se podrán seleccionar sólo aquellas bacterias que, cultivadas en un medio que contenga el antibiótico, sean capaces de sobrevivir.

16. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE • Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes: • Transformación: es un tratamiento fisico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya que pueden penetrar los ADN recombinantes en el interior celular. • Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el ADN. • Inconveniente: por la laboriosidad del proceso, sólo se utiliza sobre ovocitos o cigotos. • Ventaja: puede prescindirse del vector e introducir directamente el ADN seleccionado. • Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula. • Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante. • Transfección: método físico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de infección viral. • Microproyección o biobalística: método físico activo en el que se utiliza una micropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. • Se utiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre órganos como piel, hojas, etc.

17. Ejemplo de introducción de ADN recombinante por un vector (virus bacteriófago) en una célula anfitriona (bacteria): transfección

18. Propagación del cultivo celular de la célula anfitriona Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN recombinante contenido en ellas y, por ello, la clonación. Por ejemplo, si se han empleado bacterias, se efectúa una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo y se dejan crecer las colonias. 6. Detección y selección de clones recombinantes de entre las células del cultivo Las colonias que hayan incorporado el gen deben ser identificadas mediante el tipo de marcador incorporado. Cada una de ellas será seleccionada y transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el número de individuos de la colonia.

19. Tecnología del ADN recombinante: clonación de un gen Célula animal que produce una proteína X Bacteria Plásmidos cromosoma Plásmido aislado Gen de la proteína X aislado (ADN recombinante: gen insertado en el plásmido) Otra bacteria (célula huésped) Bacteria recombinante • 1 Por una parte, se localiza el cromosoma en el que se encuentra el gen de la proteína a clonar. • 1 Por otra parte, se selecciona un vector al que unir ese gen, generalmente un plásmido (moléculas de ADN bacteriano). • 2 Se aísla el material genético de la célula y el del plásmido de la bacteria. • 3 Se fragmenta el ADN cromosómico y el del plásmido con enzimas de restricción que cortan por puntos concretos. • 4 El gen aislado se une al plásmido por la acción de enzimas ligasas. obteniéndose ADN recombinante. • 5 Se introduce el nuevo ADN recombinante en las células anfitrionas o huésped que queramos modificar. • 6 La bacteria se cultiva y se multiplica • 7 Por último, hay que seleccionar las que contienen el gen. Clon de bacterias con el gen Las bacterias producen proteína X Fuente imagen: CMC Ed. Anaya

20. Técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) • La reacción es un proceso ”en cadena”, que permite copiar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN, pudiendo generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. • Consta de tres fases que se repiten una y otra vez: • Desnaturalización: la molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice (esto hace que se separen las dos hebras complementarias). • Hibridación: se añaden nucleótidos, cebadores y una ADN polimerasa resistente al calor (se utiliza la ADN-polimerasa llamada Taq de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). • Se induce a un enfriamiento brusco de la mezcla, lo que genera la unión de los cebadores con las hebras de ADN. • Replicación: el ADN se sintetiza o amplifica. Cada una de las hebras del ADN desnaturalizado es copiada por la ADN-polimerasa. • Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se obtiene el número de copias deseado.

21. Polimerasa Polimerasa PCR

22. Taq cebador PCR Primer ciclo 2 moléculas 4 moléculas Segundo ciclo 8 moléculas Tercer ciclo 16 moléculas Cuarto ciclo Ampliación exponencial del producto

24. Cada ciclo consta de tres etapas: • Desnaturalización: consiste en separar las dos hebras de ADN. Para ello, esta etapa se realiza a una temperatura superior a la temperatura de fusión(en torno a 90ºC). Es una fase corta, que dura entre 30 y 120 segundos. • Hibridación, o templado: se induce a un enfriamiento brusco de la mezcla, lo que genera la unión de los cebadores con las hebras de ADN. Esta fase dura entre 10 y 120 segundos y se realiza a una temperatura entre 37 y 65ºC. • Replicación, o elongación, o polimerización: es la fase en la que el ADN se amplifica. Dura entre uno y tres segundos, a una temperatura de unos 75º C. La replicación de esa secuencia se realiza en sentido 5' → 3'. Termina cuando lee toda la hebra molde, o hasta que empieza el siguiente ciclo.

26. La secuenciación del ADN (fuera de programa) Métodos de secuenciación http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm

27. Las aplicaciones de la ingeniería genética Se pueden resumir en tres grandes grupos: 1. Llevar a cabo la transgénesis o transferencia de genes. 2. La aplicación de terapias génicas. 3. La realización de diagnósticos clínicos con base genética.

28. Transgénesis • La transferencia de genes, tiene una doble finalidad: • Obtención de individuos transgénicos. • Obtención de péptidos y proteínas. • 1. Se pretende la obtención de individuos transgénicos con características ventajosas, sobre todo plantas y animales, para la mejora de la producción en agricultura y ganadería, muchos de los cuales se utilizan para consumo humano: son los alimentos transgénicos. • Ejemplos: • tomates que retrasan la maduración y resisten infecciones de virus, • patatas más ricas en almidón, • maíz autoprotegido contra sus mayores plagas, • vacas que dan más leche y de mejor calidad, etc., • microorganismos modificados capaces de degradar explosivos, descontaminar vertidos de petróleo (biorremediación), aguas residuales, lodos contaminados por metales pesados (bioadsorción), etc.

29. 2. Se persigue la obtención de péptidos y proteínas en grandes cantidades como pueden ser fármacos y otros productos de interés. • Ejemplos: • microorganismos genéticamente modificados que fabrican insulina humana o la hormona del crecimiento, factores de coagulación, • ovejas, terneras, cabras, que producen en su leche o en su semen vacunas, antibióticos, hormonas, etc. Mansa con apenas un año -nació el mediodía del 24 de septiembre de 2002- es la primera ternera de la historia capaz de producir leche con hormona de crecimiento humana • Otra línea de aplicación en estudio es la de emplear animales transgénicos para realizar xenotransplantes, es decir, transplantes de células u órganos de animales modificados genéticamente a pacientes humanos. • El más apropiado es el cerdo

30. Terapias génicas • La aplicación de terapias génicas consiste en tratamientos de enfermedades con base genética mediante la introducción de un gen en un organismo. • A la dificultad de introducir el gen deseado en las células del paciente e introducir éstas en el organismo, se añade que hay que lograr que tales genes alcancen su lugar de inserción adecuado y se expresen correctamente. • Se han realizado terapias génicas en casos de inmunodeficiencia congénita (“niños burbuja” que tienen un gen alterado que impide la producción de inmonoglobuilinas). • Se encuentran sometidas a ensayos diversas formas de cáncer que tienen origen genético, fibrosis quística, hipercolesterolemia familiar, hemofilia, artritis reumatoide, cáncer de mama, etc.

31. Diagnósticos clínicos Consiste en la realización de diagnósticos clínicos con base genética, que permiten identificar genes responsables de enfermedades para tratar de evitar o paliar la enfermedad en cuestión antes de que aparezcan los síntomas (fibrosis quística, distrofia muscular, tumores, etc.). Se emplean sondas de ADN que son fragmentos marcados radiactivamente, con una secuencia conocida y complementaria de alguno de los genes que se pretende diagnosticar Si la sonda se hibrida con el gen se puede identificar su presencia.

33. Ejemplos de transgénesis en plantas Plantas transgénicas son aquéllas en cuyas células se ha introducido un gen de interés con el que lograr una potenciación de ciertas características (mayor rendimiento de los cultivos, resistencia a la sequía, a plagas de insectos, a herbicidas, etc.) o incluso la creación de variedades y especies nuevas. La mayor parte e las que se obtienen están destinadas al cultivo

34. ¿Cómo se obtienen las plantas transgénicas?

35. La técnica más utilizada de obtención de plantas transgénicas se lleva a cabo utilizando como vector para la introducción de genes los plásmidos de Agrobacterium tumefaciens, El plásmido Ti (inductor de tumor) contiene un segmento de material genético llamado ADN-T (transferible) que tiene la propiedad de poder pasar de la célula bacteriana a las células de las plantas, e incorporarse a los cromosomas de éstas. Este mecanismo natural de ingeniería genética utilizado por Agrobacterium para transferir parte de su ADN a las células vegetales a las que infecta y produce tumores, es aprovechado artificialmente para transferir a las plantas genes de interés. www.porquebiotecnologia.com.ar (cuadernos de biotecnología)

36. Introducción en A tumefaciens Aislamiento de un gen de interés gen de interés Transferencia a células vegetales Cromosoma Plásmido Ti Transformación Planta transgénica que expresa el carácter del gen de interés Cromosoma con gen de interés Cultivo in vitro Multiplicación celular Regeneración Obtención de plantas transgénicas con Agrobacterium tumefaciens En el desarrollo de la técnica se distinguen dos etapas: transformación y regeneración: Un caso concreto es la obtención de plantas transgénicas con resistencia al herbicida glifosato. El gen que proporciona resistencia al glifosato se aisló de una cepa de A. Tumefaciens y, mediante la técnica descrita, se puede incorporar al plásmido Ti de la bacteria e introducirlo en células vegetales que se transforman en plantas resistentes al herbicida. Animación plantas resistentes a plagas de insectos http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/TrinidadSanchez.pdf

37. Plantas transgénicas 5.1. Beneficios de las plantas transgénicas 5.1.1. Resistencia a insectos 5.1.2. Resistencia a herbicidas 5.1.3. Mejora de la productividad y producción 5.1.4. Mejora de la calidad nutritiva 5.1.5. Control de enfermedades virales 5.1.6. Tolerancia al estrés ambiental 5.1.7. Producción de frutos más resistentes 5.1.8. Producción de plantas bioreactoras 5.1.9. Fijación de nitrógeno 5.1.10. Mejora con fines ornamentales 5.1.11. Producción de fármacos y vacunas 5.2. Desventajas de las plantas transgénicas 5.2.1. Los insecticidas Bt y similares 5.2.2. Producción de súper plagas 5.2.3. Resistencia a antibióticos 5.2.4. Inestabilidad genética 5.2.5. Interacción ecológica negativa 5.2.6. Riesgo a la biodiversidad 5.2.7. Transferencia horizontal de genes 5.2.8. Aparición de alergias 5.2.9. Medio ambiente PLANTAS TRANSGÉNICAS” BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN Trinidad Sánchez Martín Junio 2008 http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/TrinidadSanchez.pdf

38. Obtención de animales transgénicos

39. Producción de insulina humana por ingeniería genética en bacterias La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados.

40. Producción de insulina humana por ingeniería genética en bacterias 1.- Se fabrica en el laboratorio un ADN que codifica para la cadena A de la insulina humana, y se inserta en un plásmido bacteriano. Se fabrica también ADN que codifica para la cadena B, y se inserta en otro plásmido similar al anterior. En ambos casos, el gen para la cadena de insulina se encuentra al lado del gen bacteriano para la β-galactosidasa. 2.- Los plásmidos se han introducido (por separado) en células de Escherichia coli. Al expresarse, cada uno de ellos da lugar a una proteína de fusión, que contiene la cadena de β-galactosidasa unida a la cadena de insulina (A o B) mediante un residuo de metionina. 3.- Ambas proteínas de fusión se extraen y se purifican por separado, tratándose con BrCN, que destruye la metionina, quedando libres las cadenas de insulina. 4.- Se juntan las cadenas A y B, y mediante procedimientos químicos (oxidación) se establecen entre ellas puentes disulfuro, obteniéndose insulina en su forma final. 1 2 3 4

41. Producción de insulina humana Proteína de fusión con subunidad A del gen de la insulina Subunidad A del gen de la insulina Extracción de las proteínas de fusión Transformación en E. coli Separación de los polipéptidos A y B Promotor Promotor Formación de insulina activa Proteína de fusión con subunidad B del gen de la insulina Subunidad B del gen de la insulina La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados.