浅谈胶原蛋白

1. 浅谈胶原蛋白 10化基杨景舒

2. 结构和性质 分类及制备 SDS-PAGE分析 1 2 3

3. 我们生活中的胶原蛋白

4. 前言 胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸，其中维持人体生长所必需的氨基酸有7种，胶原蛋白中的甘氨酸占30％，脯氨酸和羟脯氨酸共占25％，是各种蛋白质中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比较高，同时还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸。

5. 胶原蛋白结构 胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，分子量为300kD，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，它们交叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构 独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。 王丽娜，黄素珍.胶原蛋白的研究进展，肉类研究，2010.1

6. 性质

7. 生物学性质——低免疫原性 林炜等认为胶原有三种类型的抗原分子,第一类是胶原肽链非螺旋的端肽,第二类是胶原的三股螺旋的构象,第三类是a -链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中,第三类只出现在变性胶原中,而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。 林炜，穆畅道，王坤余，等.皮革固体废弃物资源化Ⅱ-胶原的性质及其在医药和化妆品工业中的应用[J].中国皮革，2001，30（15）：8-11.

8. 生物学性质——生物相容性 生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收前作为新组织的骨架,还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分,都与细胞周围的基质有着良好的相互作用,表现出相互影响的协调性,并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分 Zhen-sheng等人发现胶原聚合材料具有高度的生物相容性。 黎洪棉等人研究表明：海绵状I型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性，能为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间，可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。 王娜.酶法提取猪皮胶原的工艺研究[D].四川大学硕士学位论文，200. Gu Zhen-sheng, Sheng Yao-hua, Wang Li-tian,etal. Biocompatibility research of the collagen-polymeras human implants[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation,2005,9(6):247-249. 黎洪棉，高建华，鲁峰，等.李海绵状I型胶原蛋白与免脂肪干细胞的生物相容[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，25（13）：4829-4833.

9. 生物学性质——可生物降解性 • 胶原能被特定的蛋白酶降解,即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构,所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链,只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白,胶原肽键才会断裂。胶原的肽键一旦断裂,其螺旋结构随即被破坏,断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。结缔组织细胞或炎症细胞能吞噬被胶原酶作用所得的大的片段，然后由溶酶体进一步降解为小分子多肤或氨基酸 王娜 .酶法提取猪皮胶原的工艺研究 酶法提取猪皮胶原的工艺研究 [D]. 四川大学硕士位论文， 四川大学硕士位论文， 200.

10. 生物学性质——止血和修复与功能 • 胶原具有止血性能，该性能的发挥通过两方面实现，即促进血小板凝聚和血浆结块。 • 胶原可以与血小板通过粘合、聚集形成血栓起到止血作用。当血管壁的内皮细胞被剥离时，血管中的胶原纤维暴露于血液中，血液中的血小板立刻与胶原纤维吸附在一起，发生凝聚反应，生成纤维蛋白并形成血栓，进而血浆结块阻止血流。 • 胶原的天然结构特别是其足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能力的基础。胶原是参与创伤愈合的主要结构蛋白[11]。胶原蛋白还可促进肉芽组织生成，加速创面的愈合。胶原分子对成纤维细胞的趋化反应，使胶原在伤口愈合过程中起重要作用。 Bailey A. Collagen nature's framework in the medical，food and leather industry[J].J Soc Leather Tech Chem,1992,76(4):111-127. ]郭爱华，柳大烈，赵嫚.胚胎无痕愈合的调控机制研究：（II）胎儿皮肤成纤维细胞体合成胶原的试验研究[J].中国临床康复，2002，6（2）：212-213.

11. 性质 • 理化性质 胶原蛋白质是一种两性电解质,这取决于两个因素,其一,胶原每个肽链具有许多酸性或碱性的侧基;其二,胶原每个肽链的两端有α-羧基和α-氨基,这些基团都具有接受或给予质子的能力,这些可解离的基团在特定的pH值范围内,解离产生正电荷或负电荷。 胶原(牛皮)的等电点是7. 5～7. 8,呈现出偏碱性,因为胶原的肽链中碱性氨基酸比酸性氨基酸多一点。 胶原是高分子化合物,在水溶液中具有胶体性质和一定粘度,粘度在等电点时最低,而且温度越低,粘度越大。

12. 分类 • 胶原蛋白是一类蛋白质家族。现已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因。可以形成16 种以上的胶原蛋白分子。根据它们在体内的分布和功能特点, 目前将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原, • 间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分。包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子, • Ⅰ型胶原蛋白是在动物体中发现的一种结构蛋白, 是胶原纤维组分中的一部分。它来源于表达在胶原蛋白α链上的COL1A 1和COL1A2基因。Ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生; • 基底膜胶原蛋白通常是指Ⅳ型胶原蛋白,其主要分布于基底膜;细胞外周胶原蛋白通常中指Ⅴ型胶原蛋白,在结缔组织中大量存在。羟脯氨酸是一种胶原蛋白特有的氨基酸, 约占胶原蛋白的9% ~ 13% 。 景沛. 胶原蛋白质( Ⅰ-Ⅷ) [J ] . 生命化学,1995 ,15 (6) :30 -31.

13. 制备方法——来源 胶原蛋白广泛的存在于动物的皮和骨骼中，如猪皮、牛筋、鱼、鸡的皮肤及骨骼中中也存在胶原蛋白。胶原蛋白的来源很多，但目前工业上生产主要来自牛、猪、鱼的皮肤骨骼等。但近年来由于疯牛病等流行病的发生，不少发达国家已经禁止使用从牛皮和牛骨中提取胶原蛋白 王南平，郭鹏达等.鱼鳞胶原蛋白的研制[J].水产科技情报，2004，31(6):263-264.

14. 制备方法——来源

15. 制备方法——热水提取法 • 热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，直接在热水中提取已经变性了的胶原蛋白或胶原蛋白水解物的方法，使用的温度有100℃沸水浴、60-70℃、40-42℃、45℃。钱曼等以草鱼鱼鳞为原料，在料液比1∶20（w/v），121℃条件下提取5min，最后胶原蛋白的提取率为45.57%。 钱曼，武贤壮，邱承光，等.热力法和酶解法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺及性质研究[J].食品工业科技，2007，10：70-72.

16. 制备方法——酸提取法 • 酸提取法常用的酸有：甲酸、乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸、乳酸等。低离子浓度酸可以破坏分子间盐键和希夫氏碱，引起胶原纤维膨胀、溶解。 • 迪歌·弗兰用0.l moL/L乙酸长时间浸泡皮块，皮中的未交联胶原可以溶解于醋酸中，通过冷冻干燥最后得到未变性胶原。 • 使用酸提取胶原时，根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同，可以得到分子量不均的胶原水解物。但是在等浓度酸彻底水解过程中色氨酸会全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏。因此，酸法溶出生物医用胶原要准确控制酸度、温度、时间等影响因素。 迪歌·弗兰. 胶原及其制备方法[P].CN:94104697.4. 林炜，穆畅道，王坤余，等.皮革固体废弃物资源化Ⅱ-胶原的性质及其在医药和化妆品工业中的应用[J].中国皮革，2001，30（15）：8-11.

17. 制备方法——碱提取法 • 碱提取通常使用氢氧化钠，碳酸钠等，碱性条件下提取胶原，易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏；所得产物等电点pH值较低，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸；如果水解严重，则会产生D、L型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高过L 型氨基酸，则会抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突变的作用。因此，在提取结构完整、使用安全的胶原时，很少采用碱法提取胶原。 李彦春，靳立强，危东发，等.酶法提取牛皮胶原蛋白的研究闭.中国皮革，2002，31( 23 ) : 6-9.

18. 制备方法——酶提取法 • 酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂，溶解材料，再经过其他操作提取胶原蛋白。 • 用蛋白酶处理猪皮，不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其优良的物理和生化特性。通常使用的蛋白酶主要有中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。酶法水解提取胶原的影响因素主要有酶的用量、水解pH、水解时间、以及水解温度。 • 酶法提取胶原的一般提取工艺为：预处理→酶解→盐析→透析→冷冻干燥。用酶解法提取胶原蛋白是目前比较理想的手段，它具有反应快、时间短、对环境友好，提取胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定等特点。 叶易春，但卫华，曾睿，等.酶法提取牛腱胶原的研究[J]. 中国皮革，2005，34(7)：4-7. 周文常，但卫华，廖隆理，等.猪皮胶原的提取及其结构表征[J]. 中国皮革，2004，33(13)：36-38.

19. SDS- PAGE SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳法( SDS- PAGE )——鉴别胶原蛋白及分析杂蛋 白含量。 SDS- PAGE 消除了不同蛋白质分子的电荷效应, 使蛋白质按照分子量大小分离。通过与胶原蛋白标准品的电泳条带进行比较来鉴别胶原蛋白。

20. SDS- PAGE 首先，提取Ⅰ型胶原蛋白，分为3步, 第1步：碾碎组织, 使不溶解的Ⅰ型胶原蛋白沉淀离心出来。第2步：以胃蛋白酶消化切除尾肤共价键, 使不溶解的Ⅰ型胶原蛋白呈可溶状态。第3步：用低浓度的抓化钠盐析夺取水化膜, 中和胶原分子表面的电荷, 使其相互聚集而沉淀析出最后的提取率大概在11%左右（相对总的Ⅰ型胶原蛋白）

21. SDS——PAGE • 取提取的型胶原蛋白溶液, 加人1/3体积的4*SDS Loading buffer, 在沸水浴中变性5min,取出后离心（30s,4200r/min）,取上清分装，每管40µL。配置10mL6%的分离胶，8mL5%的积层胶，1mg/mL的标准Ⅰ型胶原蛋白。每孔中依次按顺序加入高分子量标准蛋白20µL, 标准品及样品各40µL, 接通电源, 恒压电泳

22. SDS——PAGE • 电泳结束后, 卸下凝胶, 剪8张大小相似的滤纸和一张PVDF膜先用甲醇浸泡PVDF膜, 再将胶、滤纸、PVDF膜置于Transbuffer中(10min). 打开转膜仪,由负到正, 依次平铺4层滤纸、1层凝胶、1层PVDF膜及4层滤纸, 压实、赶走气泡, 打开转膜仪, 按每平方厘米1mA, 恒流转移3h. 免疫杂交反应中, 一抗为Monoclonal Anti-Collagen TypeⅠ,稀释度为1:1500, 二抗为Goat Anti-Mouse IgG-HRP, 稀释度为1:2000

23. SDS——PAGE • 把PVDF膜平放在干净的保鲜膜上, 正面(蛋白质面)朝上, 吸干膜表面的水份.加1mL显色液, 室温显色2min左右, 终止.在暗房中, 将膜的正面对着X-光片, 放入暗盒, 曝光2~5min, 取出, 显影1min, 定影10min, 冲洗 Sambrook J,Fritsch E F, Maniatis T.Molecular cloning-a laboratory manual.2ndEdition. Beijing:Science Press, 1995,884~890

24. 经ECL—Western block分析显示，随着培养代数的增加，Ⅰ型胶原蛋白的条带逐渐变淡，表明随着体外培养时间的延长，Ⅰ型胶原的分泌量逐渐减少

25. 谢谢大家！